论文部分内容阅读
同源异型蛋白是一类含有同源异型结构域的转录因子，它们控制着细胞的增殖、分化与凋亡等过程，在胚胎发育过程中对组织和器官的形成具有重要的调控作用。同源异型蛋白一般需要在细胞核中发挥其调控作用，但近期的研究发现它同时也受到核质分布变化的影响，Arx(Aristaless related homeobox protein)蛋白作为paired-like型同源异型转录因子在前脑，睾丸，胰腺和肌肉组织中均有表达且对其发育进程具有重要的调控作用。Arx蛋白包含两个核定位序列，由importinα/β复合体识别NLS1和importinβ家族蛋白(importinβ1，importin9，importin13)识别NLS2而介导Arx入核。前期研究结果表明Arx在小鼠成肌细胞C2C12分化过程中存在出核现象，并证实了Arx为一个核质穿梭蛋白及其酸性氨基酸结构域(a.a.200-250)对于Arx出核的关键性作用，然而关于Arx蛋白的出核机理尚未清楚。
在本研究中，我们重复实验证实Arx在C2C12细胞分化过程中的出核现象，并用海马神经元细胞HT22进一步验证同源异型转录因子Arx在细胞分化过程中能够出核，即在未分化的细胞中，内源Arx主要分布在细胞核中，当细胞进入分化状态时，Arx逐渐出核并主要分布在细胞质中。在前期研究结果的基础上，应用GST-pull down和免疫共沉淀(co-immunoprecipetation assay)技术，验证了Arx蛋白需要依赖于RanGTP的存在而与importinβ家族成员之一的CAS蛋白相互作用而形成三聚复合体;在体外出核实验中，用毛地黄皂苷(digitonin)处理以通透化细胞，外源添加能量重生系统与出核运载载体证实了CAS蛋白是Arx的出核受体;经RNA干扰技术沉默C2C12细胞中内源CAS基因的表达，发现在60％以上分化的细胞中Arx定位于细胞核中，证实了细胞内Arx的出核也是由CAS介导的，同时通过检测C2C12细胞的分化指标:MyHC和myogenin，发现Arx滞留在细胞核中导致C2C12细胞分化效率的降低。本研究系统提出了经CAS介导的同源异型转录因子Arx的出核解除对C2C12细胞分化的抑制作用的理论。