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目的：
门静脉高压是继发于肝纤维化及肝硬化最常见的并发症之一。当前研究表明，肝星状细胞(hepatic Stellate cell，HSC)活化收缩是促使门静脉高压形成的主要诱导因素。肝损伤时，HSC受一系列刺激因子诱导而活化，获得强烈的收缩能力，通过收缩挤压肝窦、促进瘢痕组织挛缩进而增加肝内血管阻力，最终诱导门静脉高压的形成，因此，靶向抑制HSC活化收缩成为治疗门静脉高压的新策略。挖掘靶向抑制HSC收缩进而缓解门静脉高压的高效无毒的药物是目前抗肝纤维化门静脉高压领域的研究热点。本课题组的前期研究结果表明，天然产物青蒿素衍生物双氢青蒿素(dihydroammishin，DHA)具有确切的抗肝纤维化疗效。DHA可有效抑制HSC活化并诱导其凋亡，从而减缓肝脏纤维化形成及发展，这一系列结果揭示了DHA在抗肝纤维化门脉高压中的应用潜能，但具体的疗效和作用机制仍有待深入探讨。大量研究提示，法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor，FXR)和鞘氨醇-1-磷酸受体2(sphingosine-1-phosphate receptor2，S1PR2)在HSC收缩及门静脉高压的调控中具有关键作用。本研究旨在明确DHA对肝纤维化门脉高压的治疗作用，并阐明其作用的分子机理。本研究的结果为开发DHA作为抗肝纤维化门脉高压药物提供实验依据，为DHA的作用机理研究提供全新的思路和明确的方向。
方法：
l、临床样本检测
自南京鼓楼医院肿瘤科随机选取4例临床肝癌患者癌组织和癌旁组织样本。以免疫荧光双染法考察肝癌患者癌组织和癌旁组织中HSC内FXR表达。
2、体外研究
选取永生化人肝星状细胞LX-2细胞株作为本论文体外研究对象。以鼠尾胶原凝胶收缩实验及细胞骨架染色实验评估HSC收缩能力，以钙离子(calcium，Ca2+)荧光探针检测HSC内Ca2+含量。Real-time PCR法、免疫荧光染色法及Wbstern blot法用于检测HSC内目的基因及蛋白的丰度。
3、体内研究
将48只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分成6组(每组8只)：正常对照组、CCl4模型组、DHA治疗组、奥贝胆酸(obeticholic acid，OCA)治疗组、DHA及OCA联合治疗组、DHA及没药甾酮(Z-guggulsterone，ZGGS)联合治疗组。以苏木精.伊红染色法和扫描电镜观察大鼠肝脏微观结构，以免疫组织化学染色法观察大鼠肝脏中促炎性因子表达情况，以天狼星红染色和Masson三色染色法定性评估大鼠肝脏中胶原纤维含量，以羟脯氨酸测定法定量评估大鼠肝脏中胶原特异性氨基酸的含量，以试剂盒检测大鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶的含量，以酶联免疫吸附试剂盒检测大鼠血清中干扰素n肿瘤坏死因子α、白介素6、透明质酸、层黏连蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原和转化生长因子β的含量，经门静脉和颈动脉插管检测大鼠门静脉压和平均动脉压，以Real-time PCR法、免疫荧光染色法及WeStem blot法检测大鼠肝组织中目的基因和蛋白的丰度。
结果：
临床肝脏样本的免疫荧光染色结果显示，相较于癌旁组织，癌组织中HSC内FXR荧光强度显著下降，且FXR表达随HSC活化标志物增加而逐渐降低，表明HSC内FXR表达与HSC活化程度呈显著的负相关性。
体外研究结果显示，DHA以剂量依赖性及时间依赖性的方式增加HSC中FXR的mRNA及蛋白的丰度。同时DHA可抑制HSC中促纤维化相关基因的表达，暗示DHA对HSC生物学行为具有一定的调控作用。凝胶收缩实验及细胞骨架染色结果显示，DHA可剂量依赖性地减少HSC内肌动蛋白丝的形成并抑制骨架重构，从而削弱HSC的收缩能力。DHA可降低肌球蛋白轻链的磷酸化水平。机制研究发现，DHA对HSC活化收缩的抑制作用是依赖于HSC内FXR活化的。接下来的结果显示，S1PR2介导的Ca2+依赖和Ca2+敏感信号途径是触发HSC收缩的关键信号途径。激活FXR进而抑制S1PR2介导的Ca2+依赖和Ca2+敏感信号途径是DHA抑制HSC收缩的分子基础。
体内研究结果显示，相较于正常对照组，CCl4模型组大鼠肝脏HSC中FXR荧光强度显著下降而甜SMA荧光强度增加，而DHA及OCA可明显增强大鼠HSC内FXR荧光强度，同时降低α-SMA荧光强度。血清学检测和形态学分析结果一致表明，DHA对CCl4诱导的大鼠肝损伤、炎性介质表达及炎细胞浸润有显著的改善作用。这一系列作用可被OCA进一步增强，或被ZGGS削弱。DHA和OCA均可明显降低大鼠门静脉压力及肝脏中纤维形成。机制研究表明，抑制HSC活化收缩是DHA抗肝纤维化门脉高压作用的基础。
结论：
本研究中，临床标本检验结果表明，FXR表达与HSC活化程度呈负性相关。体外部分结果表明，DHA可通过调控FXR/S1PR2信号轴进而抑制Ca2+依赖和Ca2+敏感信号介导的HSC收缩。体内部分结果表明，DHA具有确切的改善CCl4诱导的肝损伤、炎症及肝纤维化门脉高压的作用，且这一作用与DHA抑制HSC活化收缩密切相关。DHA对HSC活化收缩的抑制作用主要依赖于其对HSC内FXR的激活作用。本研究为靶向调控FXR的抗肝纤维化门脉高压药物的开发提供了一定的实验依据。
门静脉高压是继发于肝纤维化及肝硬化最常见的并发症之一。当前研究表明，肝星状细胞(hepatic Stellate cell，HSC)活化收缩是促使门静脉高压形成的主要诱导因素。肝损伤时，HSC受一系列刺激因子诱导而活化，获得强烈的收缩能力，通过收缩挤压肝窦、促进瘢痕组织挛缩进而增加肝内血管阻力，最终诱导门静脉高压的形成，因此，靶向抑制HSC活化收缩成为治疗门静脉高压的新策略。挖掘靶向抑制HSC收缩进而缓解门静脉高压的高效无毒的药物是目前抗肝纤维化门静脉高压领域的研究热点。本课题组的前期研究结果表明，天然产物青蒿素衍生物双氢青蒿素(dihydroammishin，DHA)具有确切的抗肝纤维化疗效。DHA可有效抑制HSC活化并诱导其凋亡，从而减缓肝脏纤维化形成及发展，这一系列结果揭示了DHA在抗肝纤维化门脉高压中的应用潜能，但具体的疗效和作用机制仍有待深入探讨。大量研究提示，法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor，FXR)和鞘氨醇-1-磷酸受体2(sphingosine-1-phosphate receptor2，S1PR2)在HSC收缩及门静脉高压的调控中具有关键作用。本研究旨在明确DHA对肝纤维化门脉高压的治疗作用，并阐明其作用的分子机理。本研究的结果为开发DHA作为抗肝纤维化门脉高压药物提供实验依据，为DHA的作用机理研究提供全新的思路和明确的方向。
方法：
l、临床样本检测
自南京鼓楼医院肿瘤科随机选取4例临床肝癌患者癌组织和癌旁组织样本。以免疫荧光双染法考察肝癌患者癌组织和癌旁组织中HSC内FXR表达。
2、体外研究
选取永生化人肝星状细胞LX-2细胞株作为本论文体外研究对象。以鼠尾胶原凝胶收缩实验及细胞骨架染色实验评估HSC收缩能力，以钙离子(calcium，Ca2+)荧光探针检测HSC内Ca2+含量。Real-time PCR法、免疫荧光染色法及Wbstern blot法用于检测HSC内目的基因及蛋白的丰度。
3、体内研究
将48只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分成6组(每组8只)：正常对照组、CCl4模型组、DHA治疗组、奥贝胆酸(obeticholic acid，OCA)治疗组、DHA及OCA联合治疗组、DHA及没药甾酮(Z-guggulsterone，ZGGS)联合治疗组。以苏木精.伊红染色法和扫描电镜观察大鼠肝脏微观结构，以免疫组织化学染色法观察大鼠肝脏中促炎性因子表达情况，以天狼星红染色和Masson三色染色法定性评估大鼠肝脏中胶原纤维含量，以羟脯氨酸测定法定量评估大鼠肝脏中胶原特异性氨基酸的含量，以试剂盒检测大鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶的含量，以酶联免疫吸附试剂盒检测大鼠血清中干扰素n肿瘤坏死因子α、白介素6、透明质酸、层黏连蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原和转化生长因子β的含量，经门静脉和颈动脉插管检测大鼠门静脉压和平均动脉压，以Real-time PCR法、免疫荧光染色法及WeStem blot法检测大鼠肝组织中目的基因和蛋白的丰度。
结果：
临床肝脏样本的免疫荧光染色结果显示，相较于癌旁组织，癌组织中HSC内FXR荧光强度显著下降，且FXR表达随HSC活化标志物增加而逐渐降低，表明HSC内FXR表达与HSC活化程度呈显著的负相关性。
体外研究结果显示，DHA以剂量依赖性及时间依赖性的方式增加HSC中FXR的mRNA及蛋白的丰度。同时DHA可抑制HSC中促纤维化相关基因的表达，暗示DHA对HSC生物学行为具有一定的调控作用。凝胶收缩实验及细胞骨架染色结果显示，DHA可剂量依赖性地减少HSC内肌动蛋白丝的形成并抑制骨架重构，从而削弱HSC的收缩能力。DHA可降低肌球蛋白轻链的磷酸化水平。机制研究发现，DHA对HSC活化收缩的抑制作用是依赖于HSC内FXR活化的。接下来的结果显示，S1PR2介导的Ca2+依赖和Ca2+敏感信号途径是触发HSC收缩的关键信号途径。激活FXR进而抑制S1PR2介导的Ca2+依赖和Ca2+敏感信号途径是DHA抑制HSC收缩的分子基础。
体内研究结果显示，相较于正常对照组，CCl4模型组大鼠肝脏HSC中FXR荧光强度显著下降而甜SMA荧光强度增加，而DHA及OCA可明显增强大鼠HSC内FXR荧光强度，同时降低α-SMA荧光强度。血清学检测和形态学分析结果一致表明，DHA对CCl4诱导的大鼠肝损伤、炎性介质表达及炎细胞浸润有显著的改善作用。这一系列作用可被OCA进一步增强，或被ZGGS削弱。DHA和OCA均可明显降低大鼠门静脉压力及肝脏中纤维形成。机制研究表明，抑制HSC活化收缩是DHA抗肝纤维化门脉高压作用的基础。
结论：
本研究中，临床标本检验结果表明，FXR表达与HSC活化程度呈负性相关。体外部分结果表明，DHA可通过调控FXR/S1PR2信号轴进而抑制Ca2+依赖和Ca2+敏感信号介导的HSC收缩。体内部分结果表明，DHA具有确切的改善CCl4诱导的肝损伤、炎症及肝纤维化门脉高压的作用，且这一作用与DHA抑制HSC活化收缩密切相关。DHA对HSC活化收缩的抑制作用主要依赖于其对HSC内FXR的激活作用。本研究为靶向调控FXR的抗肝纤维化门脉高压药物的开发提供了一定的实验依据。