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IL-1与TNF-α是RA发病与病程演变过程中起重要作用的两个细胞因子，临床和实验研究均证明，分别阻断这两个细胞因子都可以有效减轻RA症状，而且治疗效果有一定的互补性。Alison等将IL-1ra和PEG化的TNFR Ⅰ联合运用在小鼠CIA模型的治疗中，发现两种药物联合治疗的效果要明显好于二者的累加效果。本研究旨在通过对IL-1ra突变体和TNFR Ⅱ15-157与IgG铰链区融合蛋白的研究，进行阻断IL-1与TNF-α治疗RA的初步探索。第一，筛选更加有效地阻断IL-1的IL-1ra突变体。首先构建了IL-1ra的突变体库，通过噬菌体表面呈现，利用膜上富含IL-1R的EL-4细胞对噬菌体-IL-1ra突变体进行亲和富集和phage-ELISA筛选，共筛选到21个与EL-4和Raji细胞都特异性结合的克隆，经过序列分析确定其中有11个是发生了错义突变的IL-1ra。为了进一步检测所获得的突变体的活性，将野生型IL-1ra与获得的突变体cDNA分别插入表达载体pTIG-Trx，在大肠杆菌BL21(DE3) 进行表达。现在已经成功表达了野生型IL-1ra和10个突变体，表达产物经过镍金属螯合层析和凝胶过滤两步纯化后获得了纯度在97％以上的目的蛋白。利用EL-4、 CTLL-2细胞对目的蛋白进行体外活性检测的结果证明，获得突变体中有三个活性得到提高，其中40-22号F50L的活性提高大约有7-8倍，40-4号D95G和50-4号T76A活性大约提高5倍。第二，为了获得阻断TNF-α的生物分子，我们构建了sTNFR Ⅱ与TNF结合域(TNFR Ⅱ15-157) 与IgG铰链区的融合序列并在大肠杆菌中进行了表达。首先从U937细胞提取总RNA，利用反转录PCR扩增YNFR Ⅱ15-157 cDNA，然后通过重叠延伸PCR使FNFR Ⅱ15-157与人工合成的IgG铰链区序列融合。融合cDNA片段插入表达载体pTIG-Trx，转入大肠杆菌BL21(DE3) 后获得了可溶性的表达产物，目的蛋白经过镍金属螯合层析和凝胶过滤层析后纯度达到95％以上。体外细胞活性检测表明融合蛋白F：RⅡ15-157-FcH能够阻断TNF与受体的结合，减轻TNF的细胞毒性。sTNFR Ⅱ在大肠杆菌中有活性的表达在国内外尚未见报道。第三，建立胶原诱导的关节炎模型(Collagen Induced Arthritis，CIA)，对获得的蛋白进行体内活性评价。在分别给予IL-1ra、IL-1ra40-22、 F：RⅡ15-157-FcH，1，义摘‘要或者同11寸给r一L一:a40一22和F:R 1 1 .5_:57一l;cH lj寸，小鼠关节炎症状均有‘)少矛减轻，其，!，IL一:a40一22与F:R 1 1 .5_，，7一FcH联合川药一l寸步.1三状减轻最).J明11泛。本研究中达到十11l司的治疗效果l付IL一lra40一22剂量是wtIL一lra剂量的l/5，联合少1」药组IL一lra40一22剂量也是相应减少的，其结果证明该突变体可以有效降低在CIA模型中的用药剂量及与s1NFR联合用药时的剂量比例。 以上研究为将来进一步探索阻断IL一1与TNF一a治疗类风湿性关节炎的免疫生物治疗药物奠定了基础。