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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前世界上应用最广泛、环保的生物杀虫剂。营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Protein,VIP)是继杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)后发现的具有显著代表性的一类新型杀虫蛋白。Vip3Aa蛋白是营养期杀虫蛋白中研究最为普遍的蛋白,这类蛋白的氨基酸序列同源性很高,并且对鳞翅目昆虫具有很高的杀虫活性。但是不同Bt来源的ViP3Aa蛋白的杀虫谱和杀虫活性有所不同。Vip3Aa11和Vip3Aa39分别从Bt菌株C9和T03B001中分离得到,这两种蛋白存在39个氨基酸差异位点,氨基酸序列相似性较高,为95.06%。但是他们对某些鳞翅目昆虫表现出的不同杀虫活性。例如这两种蛋白对鳞翅目昆虫小地老虎(Agrotis ipsilon)的杀虫活性存在一定差异,LC50分别为 73.62 μg/mL(43.20～115.03)和5.43 μg/mL(2.34～11.19)。为了探究这两种蛋白对同一种昆虫产生杀虫活性差异的原因,本研究以小地老虎为靶标对象利用Vip3Aa11和Vip3Aa39两种蛋白处理构建中肠转录组数据库。共得到98.87 Gb数据,组装并去冗余后得到51,887个Unigene,总长度、平均长度、N50以及GC含量分别为64,523,651 bp、1,243 bp、2,330 bp和41.81%。将Unigene比对到七大功能数据库进行注释,最终分别有 25,411(NR:48.97%)、14,673(NT:28.28%)、18,251(SwissProt:35.17%)、18,076(KOG:34.84%)、19,743(KEGG:38.05%)、2,758(GO:5.32%)以及18,787(InterPro:36.21%)个Unigene获得功能注释。检测出23,905个CDS、4,168个SSR、预测出3,477个编码转录因子的Unigene以及对SNP进行了检测。经Nr数据库比对,小地老虎的物种分布比较接近于脐橙螟蛾(Amyelois transitella)和家蚕(Bombyx mori)。将Unigene注释到KOG数据库,并对比对上的KOG数据库25个功能组的Unigene进行分类统计。将所有Unigene比对到KEGG数据库,并统计注释上KEGG数据库leve11层级和leve12层级的Unigene。使用Blast2GO软件将所有比对上NR数据库的Unigene结果注释到GO数据库,并统计注释到GO三个方面:生物过程(Biological Process)、细胞组成(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)。本研究根据各个样品基因表达水平结果对差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)进行检测,经筛选共获得652个差异表达基因。其中因取食ViP3Aa11毒素蛋白后小地老虎中肠转录组产生的差异表达基因数量为558条,因取食Vip3Aa39毒素蛋白后小地老虎中肠转录组产生的差异表达基因数量为65条,两个处理组Vip3Aa1 1(Vip3Aa1 1-M-A)和Vip3Aa39(Vip3Aa39-M-A)间的差异表达基因数为29条。对于筛选到的差异表达基因进行聚类分析、GO功能分析和Pathway功能分析。统计分析显示有22条基因在CK-VS-Vip3Aa11和CK-VS-Vip3Aa39差异表达上下调的趋势相同。同时在差异表达基因中筛选到了 10条与免疫相关的基因、14条与代谢相关的基因、13个含有Bt毒素潜在的受体蛋白基因(包括1个Cadherin、1个ALP、1个APN、2个G-protein和8个ABC转运蛋白)和11条可能参与Vip蛋白消化作用的丝氨酸蛋白酶(Serine protease)基因。为探究Vip3Aa11和Vip3Aa39蛋白对于小地老虎中肠蛋白酶(主要为丝氨酸蛋白酶)的敏感性。本研究结合转录组数据,利用丝氨酸蛋白酶的主要成分胰蛋白酶对这两个蛋白的敏感性进行分析。体外消化结果显示,在相同时间(1h)不同浓度的胰蛋白酶处理下,88 kDa的Vip3Aa11和Vip3Aa39蛋白均能在浓度为1 mg/mL的胰蛋白酶的作用下活化出约66kDa大小的核心蛋白,并且该核心蛋白能够在高浓度的胰蛋白酶(25 mg/mL)作用下稳定存在。而在相同浓度的胰蛋白酶(1 mg/mL),不同时间的消化处理下,这两种蛋白均能在10min时被彻底的消化成约66 kDa大小的核心蛋白片段,并且在消化2 h后该核心片段仍能稳定的存在。该结果表明这两种蛋白在小地老虎中肠内的稳定性和加工速率相同,同时初步表明这两种蛋白对小地老虎产生杀虫活性不同的原因可能不是由于中肠蛋白酶的激活差异产生的。Vip3Aa蛋白主要是通过结合位点或特异性的受体与敏感昆虫中肠BBMV(Brush Border Membrane Vesicles)结合进而发挥杀虫活性。为探究Vip3Aa11和Vip3Aa39在小地老虎中肠上的受体是否相同,本研究进行了体外结合实验。结合实验结果显示,生物素标记的蛋白Bio-Vip3Aa1 1和Bio-Vip3Aa39均能与鳞翅目昆虫小地老虎的中肠BBMV(Brush Border Membrane Vesicles)结合,且Vip3Aa39蛋白的结合能力略高于Vip3Aa11蛋白,表明小地老虎中肠上存在Vip3Aa11和Vip3Aa39的受体蛋白。竞争结合实验显示,一种蛋白(Vip3Aa1l)对另一种蛋白(Vip3Aa39)存在竞争结合的作用。说明这两种蛋白在小地老虎中肠上可能存在一部分相同的受体蛋白。Ligand blot实验显示,两种Vip3Aa蛋白均能与小地老虎中肠上约30 kDa、50 kDa、70 kDa和85 kDa的蛋白结合,表明这两种蛋白在小地老虎中肠上的受体数量和大小相同。综上所述,导致两种Vip3Aa蛋白产生杀虫活性差异的原因可能是由于其与小地老虎中肠BBMV结合能力的不同。本研究通过对Vip3Aa11和Vip3Aa39蛋白处理后小地老虎中肠转录组的获得,为研究Vip3Aa蛋白在小地老虎中肠上的受体以及毒性机制提供了全面的序列资源,同时扩展了昆虫的转录组学资源,为我们能更好的理解小地老虎对Vip3Aa蛋白应答反应提供了信息资源。