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研究背景和目的:丝裂原诱导基因6(Mitogen-inducible gene 6,Mig-6)是哺乳动物细胞内最早证实存在的表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)诱导反馈抑制因子,可通过抑制EGFR信号转导途径调控细胞的有丝分裂、凋亡、应激等活动。Mig-6是一个抑癌基因,肺癌、乳腺癌、肝癌、甲状腺癌等多种人类肿瘤组织中存在Mig-6基因的表达下调,同时,有研究显示子宫内膜癌组织中也存在Mig-6的显著低表达。子宫内膜癌(Endometrial carcinoma,EC)是一种雌激素依赖性肿瘤,持续雌激素刺激促使子宫内膜增生过长甚至发生不典型增生,增加了子宫内膜癌变的几率。而孕激素能够拮抗雌激素的促内膜增生效应,大剂量孕激素已作为子宫内膜癌的保守治疗方法之一应用于临床。基因芯片结果显示,Mig-6是孕激素受体(Progesterone receptor,PR)的下游靶基因,能调节子宫内膜对孕酮的反应,影响子宫内膜从增殖期向分泌期的转化。另有研究发现子宫内膜上皮中的Mig-6是孕酮发挥作用的关键分子,Mig-6基因敲除小鼠发生子宫内膜癌的几率显著增加。在子宫内膜癌的保守治疗中,有些患者对孕酮治疗呈现低反应和无反应,这一现象被称为"孕酮抵抗"。孕酮抵抗现象不仅存在于子宫内膜癌,在子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)和多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)等病变中也存在。有研究表明,孕酮抵抗的发生与其子宫内膜组织中的Mig-6低表达相关。本研究采用Mig-6过表达质粒转染人子宫内膜样腺癌细胞株Ishikawa,增加Ishikawa细胞中Mig-6基因的表达,同时给予雌、孕激素处理,观察细胞增殖、凋亡和侵袭能力的改变及相关蛋白的表达,这将有助于了解Mig-6低表达与EC发生的相关分子机制。同时,本研究初步探索了 Mig-6在子宫内膜"孕酮抵抗"过程中的作用,将有利于指导EC、EMs、PCOS的个体化治疗。材料与方法:(1)2013年2月至2014年12月,选择在南京医科大学第一附属医院妇科接受手术治疗,术后标本经病理证实为子宫内膜癌(IA和IB期)的11例患者的内膜癌组织以及同期因子宫肌瘤行子宫切除患者的内膜组织8例,采用Western Blot技术比较内膜癌组织和正常内膜中Mig-6蛋白表达水平的差异。(2)含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基常规培养Ishikawa细胞株,实验分二组:A.阴性对照组:转染空载体质粒;B.实验组:转染Mig-6过表达质粒。脂质体法介导质粒转染,采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测转染后两组Mig-6基因的表达变化。(3)过表达Mig-6后分别加入溶剂、10-7M雌激素、10-7M雌激素+10-7M孕激素处理,流式细胞仪检测不同激素处理后过表达组、阴性对照组细胞凋亡情况的变化,Western Blot 检测凋亡相关蛋白(cleaved-caspase3、Bcl2、Bax)的表达。(4)过表达Mig-6后分别加入溶剂、10-7M雌激素、10-7M雌激素+10-7M孕激素处理,采用细胞免疫荧光技术、流式细胞术检测过表达组、阴性对照组细胞增殖情况的变化(BrdU掺入法),Western Blot检测细胞周期蛋白cyclinD1的表达,及ERK蛋白的磷酸化水平。(5)过表达Mig-6后分别加入溶剂、10-7M雌激素、10-7M雌激素+10-7M孕激素处理,Transwell小室检测不同激素处理后过表达组、阴性对照组细胞穿过膜的细胞数,通过计算侵袭指数(Invasive Index,=处理组穿过膜的细胞数/阴性对照组穿过膜的细胞数)观察MIG6对细胞侵袭能力的影响,Westem Blot检测侵袭相关蛋白(MMP2、MMP9)的表达。(6)统计分析:SPSS 20.0统计软件用于数据处理与分析,实验数据以均数±标准差(Means±SD)表示,进行正态分布、方差齐性检验,单因素样本均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05为差异具有统计学意义。结果:(l)与正常子宫内膜组织相比,子宫内膜癌组织中Mig-6蛋白的表达量下降了48.11%(P<0.05)。(2)Ishikawa细胞转染Mig-6过表达质粒后,Mig-6 mRNA和蛋白的表达量分别是阴性对照组的24.2倍(P<0.05)、2.8倍(P<0.05)。(3)过表达Mig-6后,Ishikawa细胞的早期凋亡率是阴性对照组的2.67倍(P<0.05),P4的促凋亡作用是对照组的1.39倍(P<0.05),凋亡相关蛋白cleaved-caspase3 表达水平、Bax/Bcl2 比值均显著升高(P<0.05)。(4)过表达Mig-6后,Ishikawa细胞的BrdU掺入率为阴性对照组的70.28%(P<0.05),加入E2刺激后并不能如阴性对照组一样显著促进细胞增殖(P>0.05),P4拮抗E2的促增殖效应较对照组显著提高37.90%(P<0.05),cyclinD1蛋白表达、pERK/ERK值均显著降低(P<0.05)。(5)过表达Mig-6后,穿过Transwell膜的细胞数是对照组的72.38%(P<0.05),E2的促侵袭作用较对照组下降32.37%(P<0.05),P4的抑制侵袭作用较对照组升高48.89%(P<0.05),MMP2、MMP9蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论:(1)过表达Mig-6促进子宫内膜腺癌细胞的凋亡,该过程可能通过激活细胞凋亡的线粒体途径实现。(2)过表达Mig-6抑制子宫内膜腺癌细胞的增殖,该过程可能与RAS/RAF/ERK信号通路相关。(3)过表达Mig-6抑制子宫内膜腺癌细胞的侵袭,该过程可能通过下调MMP2、MMP9蛋白表达实现。(4)过表达Mig-6能协同P4的促细胞凋亡效应、协同P4拮抗E2的促细胞增殖效应、协同P4拮抗E2的促细胞侵袭效应,可见Mig-6在孕激素生理作用的发挥中起到重要作用,能一定程度上改善子宫内膜的"孕酮抵抗"现象。