包虫病是一种危害严重的人畜共患寄生虫病,我国是包虫病发病最高的国家之一,其预防控制面临严峻挑战。在我国主要以细粒棘球绦虫感染引起的囊性包虫病为主。包虫病疫苗是理想的疾病控制手段,但仍未取得突破,制约包虫病疫苗研究的一大瓶颈是包虫病感染引起的免疫应答及其调节机制尚未明确。细粒棘球绦虫的生活史较为复杂,涉及人、牛、羊等中间宿主和犬等终末宿主,成虫寄生在终末宿主的小肠内,虫体成熟后,虫卵随着粪便排出体外。中间宿主主要通过接触终末宿主粪便,或误食虫卵感染的水、蔬菜、瓜果等而发生感染。值得一提的是,犬作为终末宿主是包虫病的主要传染源,预防控制犬被认为是阻断包虫病传播的理想途径,并且对犬实行免疫也更经济、有效。排泄分泌抗原直接与宿主相互作用,能调节宿主免疫应答,在细粒棘球绦虫感染的免疫逃避中发挥重要作用。研究感染过程中细粒棘球绦虫通过排泄分泌抗原调节宿主免疫应答关键分子及其作用机制,对于阻断包虫病传播的犬用疫苗的研究有作用意义,为包虫病疫苗的设计和优化提供重要的分子基础和新思路。第一部分细粒棘球绦虫排泄分泌抗原免疫学功能研究排泄分泌抗原直接暴露于宿主的免疫系统,是调节宿主免疫应答的主要成分。树突状细胞(dentridic cell, DC)是目前所知功能最强、也是唯一能够激活初始性T细胞(native Tcell)的专职抗原提呈细胞,控制着体内免疫反应的过程,是寄生虫调控宿主免疫应答的重要靶点之一。故通过树突状细胞对细粒棘球绦虫排泄分泌抗原的免疫学功能和作用机制进行初步的探讨。用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)诱导小鼠骨髓细胞,获取小鼠髓源树突状细胞(BMDC)。用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原和排泄分泌抗原分别刺激体外培养的BMDC,检测其DC表型和细胞因子分泌的变化以探索不同抗原活化DC的能力。将抗原刺激过得DC与T细胞共培养,检测T细胞表型及细胞因子分泌的变化以探索不同抗原对DC活化T细胞的能力的影响,探讨排泄分泌抗原免疫调节作用。结果,细粒棘球绦虫成虫排泄分泌抗原抑制DC的活化,表现为抑制MHC-Ⅱ、 CD86/CD80的表达及抑制IL-12等细胞因子的分泌；而虫体抗原能诱导DC经典活化,增强DC共刺激分子MHC-Ⅱ、CD40、CD86的表达和IL-6、IL-12p40等细胞因子的分泌。排泄分泌抗原刺激的DC与小鼠T细胞共培养,T细胞产生的细胞因子与对照组(PBS组)相比无显著变化,并发现排泄分泌抗原能诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg产生；而虫体抗原刺激后所产生的IFN-y水平大大增加,IL-4水平明显降低。DC摄取鸡卵白蛋白(OVA)后用CpG刺激,排泄分泌抗原可下调由CpG诱导的DC活化,显示出强大的抑制能力。结果表明,细粒棘球绦虫排泄分泌抗原能通过抑制DC成熟、抑制DC活化T细胞、抑制CpG诱导的DC活化,诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的产生来下调宿主免疫应答。第二部分细粒棘球绦虫排泄分泌抗原蛋白质组学分析通过蛋白质组学技术对细粒棘球绦虫成虫阶段的虫体蛋白和排泄分泌蛋白进行蛋白表达谱和抗原蛋白表达谱分析,为深入研究其中有价值的蛋白分子,阐明寄生虫-宿主相互作用机制,并寻找有效的疫苗候选分子、诊断分子及药物作用靶标奠定基础。将细粒棘球绦虫排泄分泌抗原和虫体按双向电泳要求制备蛋白样品,上样进行等电聚焦电泳和SDS-PAGE,凝胶用考马斯亮蓝染色后扫描。蛋白斑点经酶解后进行MALDI-TOF MS分析。未染色的凝胶将蛋白电转至PVDF膜上,用细粒棘球绦虫感染犬血清进行免疫印迹分析,DAB显色。质谱分析得到的肽指纹图谱在数据库搜索匹配以鉴定蛋白。结果,经双向电泳分离,细粒棘球绦虫成虫排泄分泌蛋白中分离出约50个蛋白斑点,主要集中在分子量20～100kDa,等电点4-9之间的区域,挑选出其中48个丰度较高的蛋白斑点进行质谱分析。细粒棘球绦虫成虫虫体蛋白中共分离出约200个蛋白斑点,这些蛋白斑点大部分分布在等电点4.5-9之间的区域,挑选出其中192个丰度较高的蛋白斑点进行质谱分析。用细粒棘球绦虫感染犬血清对虫体蛋白进行免疫印迹分析,得到36个具有抗原性的蛋白斑点。经MALDI-TOF MS质谱分析,鉴定出一系列与寄生虫生长、发育、运动、调控相关的蛋白。细粒棘球绦虫排泄分泌蛋白鉴定出34个蛋白斑点,9个蛋白；成虫虫体蛋白鉴定出61个蛋白斑点,32个蛋白；抗原性蛋白中鉴定出21个蛋白斑点,13个蛋白,其中7个为首次发现。经生物信息学功能分析,这些蛋白主要是细胞骨架类蛋白,分子伴侣类蛋白以及代谢调控相关蛋白。第三部分细粒棘球绦虫排泄分泌抗原分子的克隆、表达和分析在第一部分和第二部分研究结果的基础上,从5个同时存在于细粒棘球绦虫成虫虫体蛋白和排泄分泌蛋白的抗原性蛋白分子中挑选出烯醇酶(Enolase)和亲环蛋白(Cyclophilin)进行克隆、重组表达和生物信息学分析,为进一步研究该蛋白的作用机制奠定基础。抽取细粒棘球绦虫成虫总RNA,逆转录制备cDNA。以cDNA为模板,扩增出细粒棘球绦虫烯醇酶(EgEno)和亲环蛋白(EgCyp)基因,克隆入表达载体pET28a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定,并对其进行生物信息学分析。结果表明,成功克隆出EgEno和EgCyp基因,EgEno基因ORF序列为1302bp,编码433个氨基酸,EgCyp基因ORF序列为489bp,编码162个氨基酸。成功构建了重组表达系统,经SDS-PAGE分析,重组蛋白在E. coli BL21(DE3)中获得高效表达,其中重组EgEno蛋白分子量约为50kDa,重组EgCyp蛋白分子量约为22kDa。用所里棘球绦虫感染犬血清进行western blotting,两个重组蛋白均可被识别,显示出良好的抗原性。生物信息学分析显示EgEno有16个潜在抗原表位,EgCyp有7个潜在抗原表位,提示EgEno和EgCyp具有潜在免疫诊断或免疫预防等应用价值。结论1.细粒棘球绦虫排泄分泌抗原能通过抑制DC成熟,抑制DC活化T细胞来下调宿主免疫应答,其抑制作用可能是通过诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞而发挥。2.获得了细粒棘球绦虫成虫虫体排泄分泌抗原的蛋白表达谱及虫体的抗原性蛋白谱,并鉴定出一系列与寄生虫生长、发育、运动、调控相关的蛋白。3.成功克隆了两个排泄分泌抗原分子,烯醇酶和亲环蛋白基因,并在大肠杆菌原核表达系统中成功重组表达,重组蛋白显示了良好的抗原性,具有潜在免疫诊断或免疫预防等应用价值。