论文部分内容阅读
梨火疫病是由Erwinia amylovora引起的极具毁灭性的细菌病害,世界上许多国家和地区(包括我国)将其列为检疫性有害生物。本论文针对进境商用苹果果实中携带梨火疫病菌Erwinia amylovora数量有限的特点,建立了准确灵敏的套式PCR的检测体系;同时以梨火疫病菌Erwinia amylovora菌体全细胞为抗原免疫小鼠,制备了梨火疫病菌的单克隆抗体,利用单抗和免疫磁珠建立了实用、简单的免疫磁珠吸附分离技术。
从源于病菌的pEA29质粒的三对引物P29A/P29B、AJ75/AJ76和PEANT1/PEANT2中筛选灵敏度比较高的引物P29A/P29B和PEANT1/PEANT2配对组合成套式PCR检测方法,其检测灵敏度可达0.15 pg菌体DNA,是常规PCR灵敏度的1000倍,比单管套式PCR的灵敏度高10倍。利用该检测方法、EPPO推荐的单管套式PCR方法以及常规PCR方法对美国、新西兰、日本和智利等国进境的166批苹果样品进行检测,三种检测方法的样品阳性率分别为53.6%,38.0%和8.4%,试验结果表明套式PCR方法可用于进境商用健康无症苹果的梨火疫病菌快速检测。
以梨火疫病菌菌株850菌体全细胞为抗原免疫小鼠,通过多轮细胞筛选,最终得到四株稳定分泌抗体的单克隆细胞株,并制备了四株细胞株的腹水抗体,腹水抗体的间接ELISA效价为32000-64000。利用包被亲和基团的磁珠,通过非特异性吸附包被制备的单抗,进而特异性吸附抗原(目的菌),建立了简单、实用、有效和灵敏的梨火疫病菌分离方法。