研究背景保护肾脏功能对延缓慢性心力衰竭(CHF)患者的病情进程具有重要意义。流行病学证据表明,在CHF患者中,即使轻度肾功能减退也是导致预后不良的重要危险因素。近年来,CHF患者心脏和肾脏间的相互作用已成为学术界热切关注的焦点。已有研究表明,CHF患者往往伴有以肾小球滤过功能受损为主要特征的肾功能异常,同时肾脏交感神经压力反射在CHF患者中也是受损的。因此,研究早期肾功能减退在CHF病程进展中的作用,具有非常重要的意义。目前,血清肌酐(CREA)、尿素氮(UREA)是临床上用于检测肾功能最常用的生化指标,但其浓度受肌肉、饮食、众多疾病状态等诸多因素的影响而发生改变,且只有在肾功能严重下降时,其水平才高于正常值,因此不能作为诊断CHF患者早期肾功能减退的检测指标。血清胱抑素C(CysC)、内皮素-1(ET-1)、尿液微量白蛋白(MA)、β2-微球蛋白(β2-MG)、N-乙酰-β-氨基葡萄糖酐酶(NAG)、水通道蛋白-2(AQP-2)的水平很少受各种因素的影响,且在肾功能减退早期阶段就开始发生改变,因此,作为早期肾功能减退的生化指标已用于临床和实验研究。血清CysC的浓度完全取决于肾小球滤过率;在各种炎症、免疫损伤等原因引起的肾小球滤过屏障损伤时,MA从尿液漏出会增多;当肾小管损伤,重吸收功能受损时,尿液中β2-MG、NAG的水平增加;肾脏AQP-2的水平直接影响肾脏对水分的重吸收,其中部分AQP-2可脱落于小管腔被尿液冲出。因此,尿液AQP-2的水平可能能间接反映肾脏功能。血清ET-1的水平严重影响着机体的血流动力学状态,而后者与肾功能呈正相关。因此,我们也检测了两组人员血清ET-1的水平。内皮素-1(ET-1)是Yanagisawa等1988年从猪的主动脉内皮细胞分离纯化出来的由21个氨基酸组成的血管活性肽。研究发现,内髓集合管上皮细胞产生的大量内皮素,可以降低肾脏对抗利尿激素的敏感性,抑制水的重吸收,减轻CHF患者心脏的前负荷。1993年Fushimi等发现了水通道蛋白-2(AQP-2),主要在肾脏集合管主细胞的管腔侧细胞膜和胞质内表达,是受精氨酸加压素(AVP)调控的最主要的肾脏水通道蛋白,其表达及穿梭调节与集合管重吸收密切相关。因此,集合管ET-1和AQP-2均在维持机体水平衡中起着重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统的主要活性物质,在多种组织,如血管平滑肌、肾上腺、肾脏和心脏中与AT1受体结合,具有收缩血管和促进醛固酮释放等生物学效应,从而增加了心脏的前后负荷。AngⅡ受体拮抗剂(ARB)-氯沙坦钾,选择性作用于AT1受体,阻断了上述AngⅡ对机体产生的有害作用,从而有效地保护了CHF患者的心肾功能。本课题从临床病人、动物模型两个层面进行研究,并给予ARB-氯沙坦钾进行干预治疗,探讨CHF时早期肾功能减退的机制和氯沙坦钾的治疗作用。研究方法1.选取CHF患者和健康体检者分别作为CHF组和对照组。将CHF组患者随机分为常规治疗和氯沙坦钾两亚组,均给予8周治疗;体检健康人员作为对照组。治疗前检测两组血清ET-1的水平、心脏收缩功能,如左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短分数(LVFS)及肾功能,如血清CREA、UREA、CysC,尿液AQP-2、MA、β2-MG、NAG的水平。治疗8周后再次检测CHF组两亚组心脏和肾脏功能各项指标的水平。2.将小鼠分为假手术组、CHF组和氯沙坦钾组。结扎左冠状动脉前降支建立心肌梗死(AMI)后CHF模型,假手术组小鼠只穿过不结扎左冠状动脉。分别于术前、术后2周检测3组小鼠血流动力学指标,如左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室收缩末期压(LVESP)、左心室压力最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。将血流动力学指标值的显著改变作为CHF模型建立成功与否的标志。将CHF小鼠随机分为CHF组和氯沙坦钾组。术后2周CHF组和假手术组小鼠予以饮用水1.5ml灌胃,氯沙坦钾组小鼠予以0.2%氯沙坦钾1.5ml灌胃,均1/日,连续8周。术后10周检测以上血流动力学指标,另外还检测以下指标:(1) RT-PCR法检测3组小鼠肾脏组织AQP-2、ET-1 mRNA的表达;(2)免疫组织化学法检测3组小鼠肾脏组织AQP-2、ET-1蛋白表达及分布;(3)Western blot法检测3组小鼠肾脏组织AQP-2、ET-1蛋白的表达。结果1.与对照组比较,治疗前CHF组LVEDD值显著增大,LVEF、LVFS值显著降低。与治疗前比较,治疗8周后CHF两亚组患者LVEDD值均显著减小,而LVEF、LVFS值均显著增高。治疗前CHF两亚组之间各项指标值差异无统计学意义;但在治疗8周后,与常规治疗组比较,氯沙坦钾组患者LVEDD值显著减小,LVEF、LVFS值显著增高。2.治疗前对照组、CHF组血清CREA、UREA、尿液NAG、β2-MG的水平均在正常值范围内。3.与对照组比较,治疗前CHF组患者血清CysC、ET-1、尿液MA、AQP-2的水平显著增高。与治疗前比较,治疗8周后CHF两亚组患者以上指标的水平均显著降低。治疗前CHF两亚组患者上述各项肾功能指标的水平差异无统计学意义,但在治疗8周后,与常规治疗组比较,氯沙坦钾组患者以上指标的水平均显著降低。4.与术前比较,术后2周假手术组小鼠血流动力学各项指标值差异无统计学意义,而术后2周CHF组、氯沙坦钾组小鼠LVEDP值均显著增高,LVESP、±dp/dt max值显著降低。5.与假手术组比较,术后10周CHF组小鼠LVEDP值显著增高,氯沙坦钾组LVEDP值较CHF组显著降低,但仍显著高于假手术组;与假手术组比较,术后10周CHF组小鼠LVESP、±dp/dt max值显著降低,氯沙坦钾组LVESP、±dp/dt max值较CHF组显著增高,但仍显著低于假手术组。6.HE染色光镜下可见三组小鼠肾组织肾小球结构均无明显病理改变。假手术组小鼠肾小管结构也正常;CHF组小鼠肾小管上皮细胞可见空泡形成;氯沙坦钾组小鼠肾组织病理改变较CHF组有所减轻,但肾小管上皮细胞仍可见水肿、变性改变。7.与假手术组比较,CHF组小鼠肾组织AQP-2mRNA、AQP-2蛋白的表达水平显著增强;氯沙坦钾组小鼠肾组织AQP-2mRNA、AQP-2蛋白的表达水平较CHF组显著减弱,但其表达水平仍显著高于假手术组。8.免疫组织化学染色后,光镜下可见肾组织AQP-2蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒,主要位于集合管上皮细胞部位。假手术组小鼠肾组织AQP-2呈轻度棕黄色染色;CHF组小鼠肾组织AQP-2染色较假手术组显著增强;氯沙坦钾组小鼠肾组织AQP-2染色较CHF组染色稍减弱,但较假手术组显著增强。9.与假手术组比较,CHF组小鼠肾组织ET-1mRNA、ET-1蛋白的表达水平显著增强,且氯沙坦钾组小鼠肾组织ET-1mRNA、ET-1蛋白的表达水平较CHF组也显著增强。10.免疫组织化学染色后,光镜下可见肾组织ET-1蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒,主要位于肾小球和肾小管上皮细胞。假手术组小鼠肾组织可见轻度棕黄色染色;CHF组较假手术组染色增强;氯沙坦钾组染色较CHF组染色也明显增强。结论1.血清CysC和尿液MA、AQP-2的水平显著增高,表明CHF患者存在以肾小球滤过功能受损为特征的早期肾功能减退。2.尿液NAG、β2-MG水平正常,表明CHF患者肾小管重吸收功能正常。3.临床上常用的肾功能生化指标血清,如血清CREA、UREA浓度的检测对CHF患者早期肾功能无诊断意义;早期肾功能指标,如血清CysC和尿液MA、AQP-2水平的联合检测对CHF患者早期肾功能减退具有诊断价值。4.血清ET-1水平显著增高,表明CHF患者存在明显血流动力学改变。5. CHF小鼠肾组织AQP-2基因、蛋白表达水平增加,促进了集合管对水的重吸收;CHF小鼠肾组织ET-1基因、蛋白表达水平降低,可能是容量负荷增加所致,抑制了集合管对水的重吸收。6.氯沙坦钾能有效改善CHF患者的心脏收缩功能及CHF患者、CHF小鼠血流动力学状态;7.氯沙坦钾能显著改善CHF患者的肾小球滤过功能。8.氯沙坦钾能下调CHF小鼠肾组织AQP-2基因、蛋白的表达;上调CHF小鼠肾组织ET-1基因、蛋白的表达,其意义在于抑制集合管对水的重吸收,促进水钠排泄,这可能是对此药延缓CHF病程进展作用机制的新解释。