研究背景正常的骨组织通过骨形成和骨吸收间的动态平衡不断的进行重塑。在骨的所有细胞中,骨细胞约占95%并负责协调成骨细胞和破骨细胞的功能。骨细胞位于由基质形成的骨陷窝内,具有向外延伸的突触。相邻的骨细胞可通过这些位于骨小管(Thecanaliculi)中的突触相互连接。由于这种“骨陷窝-小管”系统的存在,骨细胞通过“长树突”结构相互连接成一个网络,邻近的骨细胞或骨表面的细胞(如成骨细胞和破骨细胞)可通过该网络结构进行细胞间通讯。间隙连接是相邻细胞间的连接通道。连接蛋白43(Cx43)形成了可介导骨细胞耦合的间隙连接(Gap Junction),对于维持骨细胞的活性、分化以及骨骼的发育有着重要作用。半通道(HCs)大量存在于骨细胞的表面,广泛的参与骨细胞间以及细胞内和细胞外环境的通讯。此外,半通道还在自分泌和旁分泌信号转导、细胞活性和机械传导中发挥着重要作用。基于细胞的研究表明,半通道对机械刺激可产生反应,导致这些通道的开放。间隙连接半通道允许小分子(MW<1000 Da)通过,如必需的代谢物和第二信使、PGE2、ADP和ATP等,释放的这些细胞外因子具有调节骨代谢的功能。近年来,许多研究者利用成骨细胞和骨细胞中Cx43基因敲除(cKO)小鼠模型,阐明了 Cx43在骨形成、骨重塑和机械负荷反应中的作用。然而,这些基因敲除模型无法解释Cx43半通道的特殊作用,因为Cx43同时形成了间隙连接通道和半通道。为此,本实验室建立了两个由DMP1启动子驱动的转基因小鼠模型,其中的Cx43的突变体主要在骨细胞中表达:(1)R76W,对间隙连接通道具有显性负作用;(2)△130-136,对间隙连接通道和半通道都具有显性负作用。通过这两个转基因小鼠模型,可以准确地区别Cx43间隙连接通道与半通道的功能差异。本课题组之前的工作已经表明:与WT和R76W相比,A130-136小鼠的骨骼表型有显著变化,主要包括骨密度(BMD)的增加、皮质骨的增厚、骨细胞凋亡的增加和生物力学性能变差等。Cx43半通道的损伤对骨形成、骨重塑和骨细胞活性都有负面影响。由于在之前的实验中使用的是雄性小鼠,为了检测Cx43半通道对骨的影响是否存在性别差异,本课题组选择了同龄雌性小鼠重复了部分实验。实验结果表明,Cx43半通道对雌性小鼠的骨作用与雄性小鼠相似,不存在性别差异。骨质疏松和骨量减少在绝经后妇女中较常见,具有很高的脆性骨折风险。雌激素的降低与破骨细胞介导的骨吸收增加、成骨细胞介导的骨形成减少密切相关。此外,雌激素缺乏、氧化应激(ROS)、微损伤和细胞老化等因素均可影响骨细胞的生存能力。雌性小鼠的双侧卵巢切除术(OVX)是一种成熟的手术,可以成功地模拟雌激素缺乏诱导的骨质疏松。去势手术后,体内雌激素的缺乏导致了骨转换过程加快、骨代谢增强、成骨细胞减少,最终发生骨量减少和骨质疏松。为了研究骨细胞Cx43半通道在雌激素缺乏时对骨质量和骨结构的影响,本课题组对WT、R76W和A130-136小鼠实施了双侧卵巢切除术,然后分析卵巢切除组和假手术组小鼠的骨结构、骨组织形态、骨细胞活性和骨标记物等参数。通过对皮质骨和松质骨的研究,发现在雌激素缺乏诱导的骨质疏松小鼠模型中,Cx43半通道在维持骨细胞活性、骨重塑和氧化应激相关的脂质过氧化中起着重要的作用,可保护雌激素缺乏诱导的骨丢失。第一部分Connexin 43半通道在正常骨结构和骨细胞活性中的作用研究目的检测Cx43半通道是否影响雌性小鼠的骨密度、骨结构、骨细胞活性和破骨细胞数量等。方法1.骨密度(BMD)测量。使用双能X射线吸收仪(DXA)扫描WT和转基因小鼠骨骼,获取脊柱、股骨和全身骨骼总BMD值。2.组织学、免疫组织化学和组织形态学分析。将小鼠股骨和胫骨包埋为石蜡组织块并收集为5 厚的石蜡切片。用苏木精和伊红(H&E)染色,以量化空腔骨细胞的数量。用原位细胞死亡检测试剂盒TMR-Red检测骨细胞的凋亡,并用TUNEL反应混合物标记。组织切片用白细胞酸性磷酸酶染色试剂盒进行抗酒石酸磷酸酶(TRAP)染色,定量分析松质骨和皮质骨的破骨细胞数(N.Oc)、成骨细胞数(N.Ob)。3.从骨组织中分离出mRNA,检测骨形成和骨吸收的生物标志物。利用ABI 7900 PCR 装置和 SYBR-GREEN 对 OPG 和 RANKL 的 mRNA 表达进行 RT-PCR检测。结果1.Cx43半通道损伤的转基因小鼠骨骼表型发生改变。与WT和R76W相比,△130-136小鼠的全身骨骼、脊柱和股骨的BMD值明显增加。R76W小鼠的BMD值与WT小鼠相似。2.组织学分析显示,△130-136小鼠的皮质骨中空腔骨细胞、凋亡细胞和破骨细胞数量增加。3.与对照组相比,△130-136小鼠的骨组织中RANKL的mRNA水平显著增加,同时RANKL/OPG也接近显著增加。结论1.Cx43转基因小鼠模型有助于明确Cx43间隙连接通道和半通道的特殊功能以及半通道在维持骨结构和骨细胞活性中的作用。2.Cx43半通道对骨的作用没有性别差异,雌性小鼠结果与雄性小鼠一致。3.Cx43半通道在维持正常的骨密度、骨结构、骨细胞活性和破骨细胞数量等方面具有重要作用。第二部分Connexin 43半通道在雌激素缺乏时保护骨丢失的机制研究目的研究骨细胞Cx43半通道在雌激素缺乏时对骨组织和骨结构的影响。方法1.细胞培养。MLO-Y4细胞培养,测定雌激素缺乏对骨细胞中Cx43表达的影响。2.染料吸收分析。用溴化乙锭(EtBr)染料吸收法观察雌激素对Cx43半通道功能的影响。3.动物模型和手术。实验使用17周WT(C57BL/6J)和转基因雌性小鼠行卵巢切除术来模拟雌激素减少诱导的骨质疏松症,假手术组作为对照。4.骨组织mRNA的提取及RT-PCR实验。用小鼠双侧肱骨提取出mRNA进行RT-PCR实验,检测SOD2的RNA表达。5.骨密度和Mico-CT分析。用DXA测量脊柱、股骨和骨骼总骨密度值。Mico-CT定量分析松质骨的体积/总体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间距(Tb.Sp)和骨小梁数量(Tb.N)。皮质骨分析骨干总面积(Ct.Ar)和惯性矩(MMI)等。6.股骨的生物力学性能测试。用“三点弯曲”实验测试骨的生物力学性能。7.骨组织学和组织形态测量学。采用TUNEL染色法对骨细胞的凋亡进行检测和定量。为了测量成骨细胞和破骨细胞的数量,分别用改良的Masson三色染色和TRAP染色分析。8.免疫组化。采用抗4-HNE和Cx43进行免疫组化染色,分析氧化应激诱导的脂质过氧化和骨细胞中Cx43的表达。9.Calcein和Alizarin标记的动态骨组织形态测定。小鼠腹腔分别注射Calcein和Alizarin,双标记法测定骨形成率、骨矿化率、钙沉积等。结果1.雌激素缺乏降低了 Cx43的表达和Cx43半通道的功能。2.Cx43半通道的损伤加速了卵巢切除小鼠骨表型的改变。卵巢切除后,△130-136小鼠的骨丢失增加,骨结构改变明显。3.卵巢切除术后,△130-136小鼠的骨机械性能和生物力学特性降低。4.卵巢切除术后,A130-136小鼠皮质骨的骨细胞凋亡和空腔骨细胞数量增多。5.Cx43半通道的损伤影响了卵巢切除术后破骨细胞的诱导与激活。卵巢切除后,△130-136小鼠的松质骨和皮质骨中破骨细胞数量减少。6.与WT和R76W组相比,A130-136手术组小鼠的骨动态组织形态测量参数变化不大。7.卵巢切除术后,△130-136小鼠的氧化应激水平升高。结论骨细胞中Cx43半通道的损伤影响了卵巢切除术后骨组织的分解代谢,降低了骨形成和骨吸收。Cx43半通道可能对绝经后雌激素缺乏和衰老诱导的骨丢失起到保护作用。