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[目的]筛选有效的干扰序列,研究靶向血管内皮生长因子(VEGF)的特异性小干扰RNA(siRNA)对胶质瘤U251细胞中VEGF表达的抑制作用,探讨VEGF对U251细胞的作用;裸鼠皮下成瘤直接注射siRNA,研究VEGF的特异性siRNA对在体肿瘤生长的影响,探索胶质瘤的抗血管形成的基因治疗的给药途径。[方法]一、设计并体外化学合成3对针对人VEGF基因的特异性siRNA和绿色荧光素标记的FAM-siRNA阴性对照序列,脂质体转染法将siRNA转染入胶质瘤U251细胞;通过荧光显微镜及流式细胞术检测表达绿色荧光素的U251细胞,评估siRNA的转染效率;利用RT-PCR技术测定不同序列的特异性siRNA干扰后VEGF mRNA的表达水平,筛选具有最大抑制作用的特异性siRNA为最佳序列;RT-PCR检测转染不同浓度的最佳序列的细胞中VEGF mRNA的表达以及酶联免疫吸附试验(ELISA)测定转染细胞的VEGF的蛋白水平,确定最佳转染浓度;流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期。二、裸鼠皮下接种U251细胞使其成瘤,分别将2.5ug、4.0ug和5.0ug VEGF-siRNA溶于50ul的生理盐水中,制成siRNA混悬液,注射在皮下肿瘤的不同部位,通过观察对胶质瘤细胞U251在裸鼠体内致瘤能力的影响及血管新生情况,探讨VEGF小分子干扰RNA在胶质瘤中的作用机制,并确定最适宜的给药量,为胶质瘤的基因治疗奠定基础。[结果]一、荧光显微镜及流式细胞仪观察检测显示:转染效率达95%以上;以200nM浓度转染U251细胞,3对序列对VEGF mRNA的表达水平均有不同程度的下调,其中以siRNA-1下调VEGF表达的作用最强,抑制率大于70%,选为最佳特异性siRNA;最佳序列不同浓度梯度下VEGF mRNA的表达水平可下调16%~73%,以200nM浓度为合适转染浓度,使VEGF蛋白表达减少了62.7%;VEGF表达水平的下降促进U251细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率转染组为63.06±7.12,明显高于阴性对照组和空白对照组,后两组分别为28.93±8.35和8.14±1.10。二、VEGF-siRNA对体内肿瘤的抑制作用在较大剂量应用时才有明显表现,并且随着剂量的增大抑制作用不断增强。2.0ug实验组对肿瘤生长的抑制与对照组比较不明显,4.0ug实验组对肿瘤生长的抑制率约37.1%,5.0ug实验组的抑制率达到了57.4%左右。病理切片显示瘤体内血管数量减少。[结论](1)靶向特异性siRNA可以明显抑制U251细胞株中VEGF基因的表达,诱导U251细胞发生凋亡。(2)VEGF-siRNA可以明显抑制裸鼠体内的肿瘤生长,降低其成瘤能力,抑制肿瘤内血管的形成。