【摘 要】
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随着水体富营养化等污染现象的加剧和我国污水排放标准的日益严格,污水处理中氮污染物的深度去除需求愈发迫切。厌氧氨氧化（Anaerobic ammonia oxidation,Anammox）由于其高效脱氮和低能耗等优势具备广阔的应用前景,但受限于Anammox细菌的缓慢繁殖速度,富集速度仍是自养生物脱氮领域中的瓶颈问题;同时,利用多种分子生物学手段阐明群落结构演替规律,多角度全面揭示微生物群落的代谢
【基金项目】
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邢德峰教授哈工大青年科学家工作室(污水处理与能源化)； 国家重点研发项目（无水冲式厕所系统及排泄物处理与资源化关键技术研发,项目号:2018YFD1100503）；
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随着水体富营养化等污染现象的加剧和我国污水排放标准的日益严格,污水处理中氮污染物的深度去除需求愈发迫切。厌氧氨氧化（Anaerobic ammonia oxidation,Anammox）由于其高效脱氮和低能耗等优势具备广阔的应用前景,但受限于Anammox细菌的缓慢繁殖速度,富集速度仍是自养生物脱氮领域中的瓶颈问题;同时,利用多种分子生物学手段阐明群落结构演替规律,多角度全面揭示微生物群落的代谢规律和途径,实现高效自养脱氮菌群的构建和优化,对于Anammox的工程应用具有重要的理论价值;Anammox细菌不可被纯培养,对Anammox工艺中功能细菌的研究均停留在混菌阶段,对于其代谢途径和机理的研究只能通过宏基因组的数据进行推测。通过解析Anammox纯菌基因组而重构的代谢通路对于实现Anammox的广泛应用具有极高的理论价值。针对目前Anammox细菌富集慢的问题,设计了新型的内循环固定化反应器（Internal circulation immobilized blanket,ICIB）,开发了时序固定化颗粒污泥法（Sequential immobilization and granulation approach,SIGA）,以活性污泥为接种物快速富集得到了Anammox生物膜和颗粒。应用SIGA策略在280天内接种活性污泥成功启动了Anammox工艺。其中载体预富集100天,Anammox细菌的相对丰度达到4.0～5.0%。将载体生物膜接种至ICIB反应器运行180天,ICIB反应器的氮去除率为1.11 kg·N/（m3·d）。基于16S r RNA基因的Illumina Hi Seq测序表明,ICIB反应器中生物膜上的Anammox细菌（Candidatus Kuenenia,Candidatus Brocadia和Candidatus Jettenia）的相对丰度达到42.5～50.6%,颗粒污泥中则达到45.3～47.1%。这表明,在一个ICIB反应器中同时形成了高丰度Anammox细菌的颗粒污泥和生物膜。Anammox生物膜的存在和内部循环促进了Anammox颗粒污泥的形成,在合适的水力剪切条件下,从载体生物膜上逸出的游离Anammox细胞提供了可以形成Anammox颗粒的亲本细胞。这项研究为使用基于ICIB和SIGA的活性污泥接种物快速启动厌氧氨氧化提供了新的策略。利用多组学技术系统解析了Anammox群落结构变化规律和其脱氮代谢机制。在180天内启动了一个Anammox反应器,总氮去除效率达到92.2%,氮去除负荷（Nitrogen removal rate,NRR）达到1.21 kg·N/（m3·d）。16S r RNA基因Illumina测序结果证实群落中优势菌属为Candidatus Kuenenia（33.0±1.6%）和SM1A02（28.1±0.6%）,相对丰度与荧光原位杂交（FISH）分析结果一致;基于16S r RNA全长基因的Pac Bio SMRT测序对优势种群进行了种水平的鉴定,确定富集的Anammox细菌为Candidatus Kuenenia stuttgartiensis（17.7±2.7%）,与二代测序相比相对丰度略低;宏基因组学测序检测出ICIB反应器中微生物群落的主导菌群为Candidatus Kuenenia（7.9±0.2%）,无论是群落结构还是相对丰度均与FISH结果相差很大。另一方面基于宏基因组的结果对Anammox的相关功能基因进行了鉴定和分析,解析了Candidatus Kuenenia可能具有固氮潜力。比较得知二代测序最适宜Anammox细菌的丰度检测,宏基因组测序则可以提供基因代谢功能分析。启动了短程硝化-厌氧氨氧化耦合工艺,并从中获取了Anammox纯细菌的单细胞水平样品,揭示并重构了Anammox细菌的代谢通路。在150天内成功启动短程硝化SBR反应器,总氮去除率超过90%,出水中亚硝酸盐和硝酸盐浓度均低于5 mg/L。基于16S r RNA基因的群落结构分析表明,短程硝化颗粒污泥细菌群落中以AOB Nitrosomonas（5.9%）为主,古菌群落中AOA始终占据主导地位,启动后的主导菌群变成了AOA古菌Candidatus Nitrosotenuis（31.3%）;开发了基于拉曼光谱聚类的单细胞分选技术,成功获取Candidatus Kuenenia stuttgartiensis细胞的纯菌生物样品及其拉曼特征光谱;对Candidatus Kuenenia stuttgartiensis的碳、氮、呼吸链等代谢通路进行了解析,并首次发现了Candidatus Kuenenia stuttgartiensis具有EMP代谢途径。本课题开发了厌氧氨氧化工艺快速启动的新方法,揭示了Anammox微生物种群互作机制,重构了Candidatus Kuenenia stuttgartiensis的基因草图,为Anammox的实际应用提供了重要的理论依据和技术参照。
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