论文部分内容阅读
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)主要通过血液途径传播,能引起急、慢性肝炎并可导致肝硬化和肝细胞癌。全世界现有HCV感染者约1.7亿,严重影响人类健康,其治疗常用干扰素和利巴韦林,应答率也仅约为40%,因此,研制HCV疫苗具有重要意义。HCV基因组全长一般在9379～9481nt之间,编码一个约含3000个氨基酸的多聚蛋白前体,在宿主和病毒自身蛋白酶的加工下产生结构蛋白(C、E1和E2)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4和NS5等)。结构蛋白E2中的第384-410位氨基酸区段是个高度变异区,称为HVR1。众多实验表明,HVR1中存在中和表位,其相应的中和抗体不仅可以阻止病毒对靶细胞的粘附,而且在感染痊愈过程中起着重要作用,但该区段高度变异,诱生的抗体具有株特异性,往往对不同HCV变异株的感染缺乏交叉保护,给丙型肝炎疫苗的研制造成困难。 本实验室在前期工作中,曾针对HCV的免疫学特性,优选了数条能模拟大多数HVR1免疫原性的HVR1模拟表位,同时联合应用多条HCVT细胞表位,设计合成出了一段包含9条HCVE2蛋白HVR1(384～410aa)模拟B细胞表位,2条C区保守CTL表位(35～44aa,132～140aa)、1条NS3区保守CTL表位(1073～1081aa)及1条NS3区保守Th表位(1251～1259aa)的多表位抗原融合基因(multi-epitope fragment combination,mfc),并对其免疫原性进行了分析,发现该多表位抗原基因能够诱生针对HCV的特异性免疫应答。在此基础上,为进一步提高mfc基因的免疫原性,本研究将HAsAg基因融合在mfc基因的N端,构建了以HBsAg为佐剂的HCV DNA疫苗,在小鼠中检测了其免疫效果;同时,本研究从mfc基因中优选出5条HVR1模拟B细胞表位基因(hcvme),与gst基因融合后经大肠杆菌表达并纯化出重组蛋白GST-HCVME,通过小鼠免疫实验对其免疫原性进行了分析;此外,本研究还检测了mfc基因在大肠杆菌中的重组表达产物—GST-MFC蛋白对丙肝患者外周血淋巴细胞的增殖作用情况。 一、以乙型肝炎表面抗原基因为佐剂的丙型肝炎病毒多表位DNA疫苗的构建及在小鼠中的免疫应答研究 为增强HCV多表位DNA疫苗的免疫效果,我们将HBsAg基因融合在mfc基因的N末端,构建了HBsAg+MFC的重组HCV DNA疫苗,体外转染HEK 293T细胞检测了其瞬时表达情况,体内实验采用肌肉注射法接种BALB/c小鼠对其免疫效果进行了评价,检测了其诱导的抗体产生情况、特异性抗体同HVR1合成肽的交叉反应率、MFC蛋白特异性的免疫小鼠脾细胞增殖反应及细胞因子IFN-γ