肝内胆汁淤积(intrahepatic cholestasis, IC),又称淤胆型肝炎,是由各种病因引起的肝细胞内胆汁分泌器结构与功能障碍,导致肝内胆汁淤滞和血液中胆汁成分增多,引起的以部分或完全性胆汁流阻滞为特征的综合症候群,临床表现为重度黄疸、皮肤瘙痒、大便颜色浅、心动过缓,伴血清生化指标升高等系列症状。其主要临床表现与肝外阻塞性黄疸相似,但患者并无胆道机械性阻塞。IC也是多种肝病所共有的基础性病变,其进行性发展最终可致肝硬化、肝衰竭而威胁生命。IC的常见病因包括感染、代谢、免疫以及遗传等,发病机制较为复杂,迄今尚未完全清楚,一般认为主要是由致病因子导致的肝细胞细胞器和毛细胆管损伤,造成胆汁排泌障碍,或者毛细胆管内胆栓形成。目前用于治疗肝内胆汁淤积症的可选药物不多,亦无特效药物,故研究新颖的治疗肝内胆汁淤积的药物并阐明其作用机制具有重要价值和意义。牛黄(Calculus Bovis, Niuhuang)是我国传统名贵中药,具有较好的保肝护肝作用。牛黄天然来源于牛科动物牛的胆囊、胆管或肝管结石,稀有紧缺,近年来国内开始广泛应用体外培育牛黄(Calculus Bovis Sativus, CBS)作为天然牛黄的理想代用品,其药理作用与牛黄近似。本文主要就体外培育牛黄对肝内胆汁淤积大鼠的保护作用及机制进行了系统研究。第一部分考察CBS对ANIT诱导肝内胆汁淤积大鼠的作用。雄性Wistar大鼠30只随机分为5组,每组6只：正常对照组,模型组,ANIT+CBS50mg/kg组,ANIT+CBS100mg/kg组,ANIT+CBS200mg/kg组。正常对照组每日灌胃给予生理盐水,其余各组每日灌胃给予相应剂量的药物,于第5日,正常对照组一次性灌胃给予橄榄油,其余各组一次性灌胃给予ANIT橄榄油溶液(100mg/kg)。造模后继续给药,于造模后48h,麻醉固定大鼠,行胆管插管引流术,收集2h内胆汁,计算胆汁流量；采血分离血清测定血清生化指标；取部分肝脏组织固定后行HE染色及透射电镜观察,部分肝脏组织匀浆后测定SOD活性及MDA含量。结果发现：1.CBS显著逆转ANIT导致的大鼠胆汁流量下降；2.CBS下调ANIT诱导肝内胆汁淤积大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL值；3.CBS减轻ANIT诱导肝内胆汁淤积大鼠肝组织病理损伤；4.CBS升高ANIT诱导肝内胆汁淤积大鼠肝组织SOD活性,减少肝组织MDA含量。结果显示,CBS(50,100or200mg/kg)对ANIT诱导的肝内胆汁淤积大鼠具有明显保护作用,可显著减轻ANIT引起的肝脏损伤,机制可能与减少炎性细胞浸润,减轻肝脏氧化损伤有关。第二部分考察CBS对EE诱导肝内胆汁淤积大鼠的作用。雄性大鼠36只随机分为6组,每组6只：正常对照组,模型组,EE+CBS50mg/kg组,EE+CBS150mg/kg组,CBS50mg/kg组,CBS150mg/kg组。正常对照组每日给予丙二醇皮下注射,同时给予NS灌胃,模型组每日给予EE(5mg/kg)皮下注射,同时给予NS灌胃,EE+CBS50mg/kg组每日给予EE(5mg/kg)皮下注射,同时给予CBS (50mg/kg)灌胃,EE+CBS150mg/kg组每日给予EE(5mg/kg)皮下注射,同时给予CBS (150mg/kg)灌胃；CBS50mg/kg组每日给予丙二醇皮下注射,同时给予CBS (50mg/kg)灌胃,CBS150mg/kg组每日给予丙二醇皮下注射,同时给予CBS (150mg/kg)灌胃。连续给药5天后,各组大鼠麻醉固定,行胆管插管引流术,收集2h内胆汁,计算胆汁流量；采血分离血清测定血清生化指标；取部分肝脏组织固定后行HE染色,部分肝脏组织匀浆后测定SOD活性及MDA含量。结果发现：1.CBS显著逆转EE导致的大鼠胆汁流量下降；2.CBS下调EE诱导肝内胆汁淤积大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL值；3.CBS减轻EE诱导肝内胆汁淤积大鼠肝组织病理损伤；4.CBS升高EE诱导肝内胆汁淤积大鼠肝组织SOD活性,减少肝组织MDA含量。结果显示,CBS对EE诱导的肝内胆汁淤积大鼠具有保护作用,可显著减轻肝脏损伤,机制可能与减轻肝脏氧化损伤有关。第三部分考察CBS对EE诱导肝内胆汁淤积大鼠肝脏Mrp2、Bcrp表达的影响,对肝脏雌激素受体ERa、转运体调节蛋白PDZK1表达的影响。雄性大鼠36只随机分为6组,每组6只：正常对照组,模型组,EE+CBS50mg/kg组,EE+CBS150mg/kg组,CBS50mg/kg组,CBS150mg/kg组。正常对照组每日给予丙二醇皮下注射,同时给予NS灌胃,模型组每日给予EE(5mg/kg)皮下注射,同时给予NS灌胃,EE+CBS50mg/kg组每日给予EE(5mg/kg)皮下注射,同时给予CBS(50mg/kg)灌胃,EE+CBS150mg/kg组每日给予EE(5mg/kg)皮下注射,同时给予CBS(150mg/kg)灌胃；CBS50mg/kg组每日给予丙二醇皮下注射,同时给予CBS(50mg/kg)灌胃,CBS150mg/kg组每日给予丙二醇皮下注射,同时给予CBS(150mg/kg)灌胃。连续给药5天后,处死各组大鼠,取肝脏组织,采用RT-PCR和Western blotting方法检测Mrp2、Bcrp、ERα、PDZK1表达。结果发现：1.EE显著下调大鼠肝脏组织Mrp2、Bcrp的蛋白表达,显著降低BcrpmRNA表达；2.EE显著下调大鼠肝脏组织PDZK1的mRNA及蛋白表达,上调大鼠肝脏组织ERa的蛋白表达；3.与模型组相比,CBS显著上调Mrp2、Bcrp mRNA及蛋白表达,上调PDZK1mRNA及蛋白表达,下调ERα蛋白表达。结果显示：CBS对EE诱导肝内胆汁淤积大鼠肝脏转运体Mrp2、Bcrp表达具有上调作用；CBS可能通过恢复肝脏转运体的表达,增加胆汁流量,发挥保护作用；同时,CBS对EE诱导肝内胆汁淤积大鼠肝脏组织转运体调节蛋白PDZK1表达具有明显上调作用,对ERa蛋白表达具有下调作用；因此,CBS可能通过影响雌激素信号通路及相关蛋白发挥对肝脏转运体的上调作用。第四部分考察CBS对肝内胆汁淤积大鼠Mrp2、Bcrp转运功能的影响。雄性Wistar大鼠24只随机分为4组,每组6只：正常对照组,模型组,ANIT+CBS50mg/kg组,ANIT+CBS150mg/kg组。正常对照组、模型组每日灌胃给予生理盐水,ANIT+CBS组每日灌胃给予相应剂量的药物；于第5日,正常对照组一次性灌胃给予等量的橄榄油,其余各组一次性灌胃给予ANIT橄榄油溶液(100mg/kg)。造模后继续给药,于造模后48h,禁食过夜,麻醉固定大鼠,行胆管插管引流术；尾静脉注射一次性剂量的黄芩苷溶液(20mg/kg),按照预定时间点收集胆汁,冻存待测；雄性Wistar大鼠24只随机分为4组,每组6只：正常对照组,模型组,EE+CBS50mg/kg组,EE+CBS150mg/kg组。正常对照组每日给予丙二醇皮下注射,同时给予NS灌胃；模型组每日给予EE(5mg/kg)皮下注射,同时给予NS灌胃；EE+CBS组每日给予EE(5mg/kg)皮下注射,同时给予CBS灌胃。连续给药5天后,禁食过夜,麻醉固定大鼠,行胆管插管引流术；尾静脉注射一次性剂量的米托葸醌溶液(2mg/kg),按照预设时间点收集胆汁样品,冻存待测。结果发现：1.ANIT导致肝内胆汁淤积大鼠静脉注射黄芩苷经胆汁排泄速率降低,累积排泄量减少；2.CBS可部分对抗这种抑制效应；与模型组相比,CBS明显增加黄芩苷经胆汁排泄量；3.EE导致肝内胆汁淤积大鼠静脉注射米托蒽醌经胆汁排泄速率降低,累积排泄量减少；4.CBS可部分对抗这种抑制效应；与模型组相比,CBS明显增加米托葸醌经胆汁排泄量。结果显示：CBS可以增加ANIT诱导肝内胆汁淤积大鼠黄芩苷的胆汁排泄量,可能与CBS增强Mrp2转运功能有关；CBS可以增加EE诱导肝内胆汁淤积大鼠米托葸醌的胆汁排泄量,可能与CBS增强Bcrp转运功能有关。