背景与目的β-地中海贫血是由一系列不同的遗传变异引起的,根据其临床表型可以分为轻型地中海贫血、中间型地中海贫血和重型地中海贫血。重型地中海贫血是一种临床表型非常严重的β-地中海贫血,主要表现为α链和非α链比例的严重失衡、严重的无效红细胞造血以及依赖红细胞输血来维持生存。平均每月一次的输血使这些病人出现铁超载,这些铁沉积在他们的内脏里,需要铁螯合剂进行除铁治疗来免除这种威胁1。β-地中海贫血异常造血主要表现在早期红系祖细胞（原红细胞和更早阶段）的膨胀增殖和无效造血2。β-地中海贫血患者骨髓的红系前体细胞数量是正常人的五到六倍,他们主要增加早幼红细胞和中幼红细胞数量,降低晚幼红细胞数量3,4。另外,β-地中海贫血骨髓红细胞由早期的中幼红细胞开始就含有电子密度高度的α珠蛋白聚合物,并且随着红细胞的成熟这种聚合物体积增大和出现的频率增多5。这些聚合物能富集在红细胞膜上,并对红细胞膜造成损伤。而胎儿珠蛋白基因的表达能一定程度缓解α链和非α链比例的失衡,从而缓解β-地中海贫血患者严重的贫血症状。胎儿血红蛋白简称HbF,它是由两条γ肽链和两条α肽链组合而成。γ-珠蛋白肽链由11号染色体上的HBH1和HBG2基因编码。HbF主要在胎儿时期表达,它是胎儿时期运输氧气的主要血红蛋白。HbF的表达在胎儿出生前后逐渐降低,而这时逐渐开始表达成人血红蛋白（HbA）,出生后1到2岁达到最高峰并维持终生。有一部分人在β-珠蛋白基因簇调控区上发生的基因突变抑制了γ到β开关,结果导致他们终生HbF升高,这类人被称为患有良性的遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症（HPFH）。有趣的是,个体复合HPFH和β-地中海贫血突变表现出较轻的疾病严重性,在少数病例中甚至是无症状的6,7。这些临床观察提示通过基因编辑手段或者药物诱导逆转γ到β珠蛋白开关可能是治疗β-地中海贫血一个有效的途径。另外,个体仅仅有HPFH突变是无症状的,证明成人持续高表达HbF没有不良后果。一组无输血史地中海贫血患者体内的HbF水平是与疾病的临床严重程度成负相关的7。因此,诱导HbF表达对缓解β-地中海贫血患者严重的临床症状具有重要意义。HbF表达水平存在个体差异性,它受到很多基因元素的调节。根据前人研究,HbF相关的三个重要数量性状位点已经被确定。在llp15染色体上HBG2基因5’端上游158bp上的C/T单核苷酸多态性8,6q23染色体上HBSIL-MYB基因间区多态性9以及2p16染色体BCLlla基因上的多态性10,它们可以调控HbF进而影响β-地中海贫血疾病的严重性11。进一步研究表明BCLlla是γ-珠蛋白基因一个重要的抑制性转录因子,它可以抑制HbF表达。在镰刀形细胞贫血转基因小鼠模型中失活BCLlla使该模型小鼠持续高水平表达全细胞型HbF,纠正了镰刀形细胞贫血小鼠血液和病理上的缺陷12。BCLlla可能通过结合其它转录因子介导沉默γ珠蛋白基因,例如结合在染色体上γ珠蛋白启动子的SOX6,或是通过直接与β珠蛋白基因簇不同区域结合来作用的13。确实,在β-珠蛋白基因簇上的一些HPFH突变提升γ珠蛋白基因转录,其原因是突变阻止了 BCLlla的结合14。利用CRISPR/Cas9靶向删除小鼠同源BCLlla上的+62增强子,小鼠神经细胞和B淋巴细胞BCLlla表达水平正常,小鼠健康出生且没有伴随B细胞成熟障碍,但是在红系祖细胞中BCLlla水平大幅度降低15。最近报道,红系转录因子KLF1是γ珠蛋白基因到β珠蛋白基因开关的一个关键的调节因子16。在人类和小鼠红系祖细胞中敲降KLF1可以显著性的减少BCLlla表达水平以及增加γ珠蛋白基因表达水平与β珠蛋白基因表达水平比率,提示KLF1是通过直接激活β珠蛋白基因表达的和间接抑制Y珠蛋白基因表达来调控珠蛋白基因开关的17。还有一些常见的转录因子调控HbF表达水平。MYB是一个转录因子,它能在造血过程中发挥多功能角色。可以减少MYB基因表达的常见DNA多态性和稀有突变都表现出提高红系祖细胞中的HbF水平18。HBS1L-MYB基因间区的突变与BCL11a位点上的突变对HbF的升高具有累加效应,这两个基因一起可以产生比其它通路更大的作用19。最新报道,由ZBTB7A基因编码的白血病淋巴瘤相关因子LRF是一个ZBTB转录因子,它是通过C末端C2H2类型的锌指结构结合到DNA上的,而且它还可能通过它的N端BTB结构域招募转录抑制蛋白复合物20。LRF是一个γ珠蛋白基因的抑制性转录因子,在成人阶段它结合到γ珠蛋白基因上使染色体保持致密的核小体结构进而使沉默Y珠蛋白基因的表达。LRF的沉默机制是独立于BCL11a沉默胎儿珠蛋白基因的另一种途径,它可以通过NURD抑制复合物发挥这种抑制作用的21。这些研究都为后续的HbF重新激活提供了一定的理论基础。表观遗传学包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA干扰等修饰。DNA上的胞嘧啶甲基化修饰通常与转录沉默有关22。DNA甲基化的改变影响激活复合物或抑制复合物结合到基因上,进而影响基因的表达23。最近有试验证明,珠蛋白基因上DNA甲基化的改变会影响珠蛋白基因开关的转换24。增加组蛋白乙酰化一直以来被认为是与染色质解除压缩和激活基因表达有关。这些年,一些组蛋白去乙酰化酶抑制剂被陆续发现或合成。在一些模式生物中,丁酸和它的派生物被发现可以诱导沉默的胚胎与胎儿珠蛋白基因表达25。升高HbF水平表达与Y珠蛋白基因附近组蛋白乙酰化的升高有关26。miRNA是一组小的短调控非编码RNAs,它可以通过mRNA降解或者抑制蛋白翻译来调控靶基因的表达,miRNA也参与Y珠蛋白基因调控。MiR-486-3p通过结合BCL11a的3’UTR直接抑制该基因的表达,进而重新开放Y珠蛋白基因的表达27。在人类13-三体综合征中,持续表达HbF水平和提升胚胎血红蛋白表达水平,延迟了γ珠蛋白基因到β珠蛋白基因的开关。进一步研究发现miR-15a,-16-1高水平表达抑制了MYB基因表达,而MYB在沉默胎儿珠蛋白基因和胚胎珠蛋白基因中扮演重要角色。因此,表观遗传学可能是重要的调控途径去重新激活HbF水平进而减轻β-地中海贫血患者的严重症状28。最近研究,组蛋白精氨酸甲基化转移酶PRMT5给组蛋白H4第三位精氨酸添加对称性甲基化（H4R3me2）,H4R3me2标记招募甲基化转移酶DNMT3A,DNMT3A使γ珠蛋白基因启动子上的CG位点甲基化,进而抑制γ珠蛋白基因的表达29,而PRMT5依赖LYAR结合在Y珠蛋白基因启动子上,发挥着抑制γ珠蛋白基因表达的重要作用30。本研究目的在于探讨LYAR结合序列上的HBG1-rs368698783 SNP位点能否通过影响LYAR的结合,进而影响PRMT5复合物的招募,最终影响γ珠蛋白基因启动子DNA甲基化水平和γ珠蛋白基因的表达,为重新激活HbF研究提供新思路和新途径以及为β-地中海贫血的治疗提供精确的靶点。材料与方法1.基因型的定义HBB 基因型类别定义如下（β0）:HB:c.126_<sub>129delCTTT,HBB:c.52A>T,HBB:c.216₂17insA,HBB:c.92 + lG>T,HBB:c.316-197C>T,HBB:c.130G>T,HBB:c.91A>G,HBB:c.84₈5insC,HBB:c.165-177delTATGGGCAACCCT,HBB:c.45_<sub>46insC,HBB:c.315+1G>A,HBB:c.287₂88insA,HBB:c.113G>A,HBB:c.93-lG>C;2.β-地中海贫血病人骨髓CD235阳性细胞分选抽取9例β0/β0地中海贫血病人骨髓,肝素抗凝,使用1XPBS五倍稀释,用聚蔗糖淋巴细胞分离液分离单个核细胞,用CD235阳性磁珠手工分选有核红细胞。3.检测DNA的甲基化水平我们用酚氯仿提取细胞DNA,使用重亚硫酸盐处理DNA后,用纯化柱纯化回收DNA。我们使用巢式PCR扩增目的片段,然后切胶回收PCR产物,接着连载体-挑克隆-摇菌-送测序。测序结果显示甲基化的胞嘧啶为C,未甲基化的胞嘧啶为T。4.双荧光素酶报告基因实验设计带酶切位点的目的片段PCR引物,经高保真酶扩增后,纯化回收产物,双酶切目的片段和自带HS2增强子和SV40启动子的PGL3载体,切胶回收,连接转化提质粒,4D细胞核转染系统转染K562细胞,最后用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光值。5.电泳迁移率实验和抗体超迁移实验根据文献合成LYAR结合的探针序列（野生型的热探针与野生型和突变型的冷探针）,退火成短双链DNA序列。使用核蛋白提取试剂盒提取新鲜的核蛋白。在冷竞争实验中,野生型或突变型冷探针是野生型热探针的10倍、30倍和90倍,使用专门的EMSA操作试剂盒操作的。为了验证热探针与蛋白质的结合带有没有LYAR蛋白,我们在其中一孔加LYAR蛋白抗体,另一孔加对照双蒸水进行超级迁移实验。6.染色质免疫共沉淀实验（CHIP）β-地中海贫血病人骨髓CD235阳性细胞分选后,我们对大约10的七次方细胞进行甲醛交联（终浓度为1%）,随后甘氨酸淬灭、超声破碎DNA、目的抗体富集、解交联和DNA提取。我们使用探针法定量HBG基因+25位上HBG2-G和BG1-A各自所占的比例。7.统计学处理所有的统计学检验均采用t检验,P<0.05认为两组数据间有显著性差异。数据的整理和处理,使用IBM SPSS Statistacs 20软件,作图先用GraphPad Prism 5软件画图,再用Adobe Illustrator CS4软件进行修改。主要结论1.β 0/β 0地中海贫血患者HBGl-rs368698783 G/A变异使HBG-启动子附近CG位点甲基化水平降低,证明了 HBG1+25位突变介导的是去DNA甲基化途径。2.体内外实验证明HBG1启动子上rs368698783 G/A变异使得LYAR蛋白富集在γ珠蛋白基因的量减少,进而通过LYAR,PRMT5和DNMT3A去甲基化通路,使得Y珠蛋白基因启动子附近的CG位点甲基化降低,从而开放了基因的表达。