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石斑鱼是我国重要的一种海产经济鱼类。近年来,由于过度追求养殖效益、养殖环境恶化等因素存在,病害问题频繁发生。其中以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)引发的弧菌病尤为严重,一度引发石斑鱼大量死亡,且常规的抗生素治疗已无法防控该病。为实现水产养殖业健康持续发展,疫苗接种是防控水产动物疾病的最佳策略之一。实验室在前期工作中已表明石斑鱼接种经福尔马林溶液灭活的哈维氏弧菌疫苗(FKC)可有效抵抗弧菌病感染,为增强疫苗免疫原性,本研究分别以多种糖类作为疫苗佐剂,通过对珍珠龙胆石斑鱼腹腔接种疫苗以评估各佐剂对疫苗的增强效果。研究结果为进一步增强哈维氏弧菌灭活疫苗对珍珠龙胆石斑鱼抵抗哈维氏弧菌感染的保护效果提供参考价值。本实验以黄芪多糖(APS)、壳寡糖(COS)、β-葡聚糖(β-glucan)为哈维氏弧菌灭活疫苗的候选佐剂,通过腹腔注射研究不同佐剂对灭活疫苗的增强效果。免疫5 w后,FKC+COS、FKC+APS、FKC+β-glucan、FKC的RPS分别为80%、72%、68%和55%,明显高于对照组(32%),而注射COS、APS和β-glucan的RPS仅分别为52%、47%和42%。ELISA结果表明,接种KFC+COS疫苗的鱼能使抗体效价上调至最高水平1:512,而接种FKC+APS、FKC+β-glucan和FKC的石斑鱼抗体效价均为1:256,整个实验期间各免疫组与对照组存在显著差异(P<0.05)。血清总蛋白含量检测变化趋势与抗体效价类似。对溶菌酶(LZM)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性检测与分析表明,APS、COS和β-glucan作为FKC佐剂时能显著提升石斑鱼血清中LZM活性(P<0.05),最高出现在第2 w的FKC+APS组,其次是第3 w的FKC+β-glucan,而接种FKC或APS或COS或β-glucan则差异不显著(P>0.05)。各免疫组的CAT活性均显著提升,与对照组相比呈显著差异(P<0.05),其中最高表达量出现在FKC+APS组(2 w),其次为FKC+COS。接种FKC+β-glucan使SOD活性明显增强,并在第3 w被上调至最高水平。因此,在抗原中添加COS,尽管LZM和CAT活性低于其他组,但其能为珍珠龙胆石斑鱼提供更高的免疫保护和更高的抗体滴度。评价FKC中添加不同浓度的COS对石斑鱼免疫保护的影响。分别制备抗原中含浓度为2 mg/m L、4 mg/m L、6 mg/m L、8 mg/m L和10 mg/m L的COS的疫苗。免疫5 w后,FKC、FKC+COS2、FKC+COS4、FKC+COS6、FKC+COS8和FKC+COS10组提供的RPS分别为66%、68%、70%、83%、100%和100%,表明RPS依赖于COS浓度。在免疫期间,所有免疫组血清抗体效价与对照组相比呈显著差异(P<0.05)。抗体水平依赖于FKC中COS浓度,其中抗体效价最高水平出现在第3 w的FKC+COS10组,其次是FKC+COS8组,两组抗体效价均为1:1024。上述结果表明,在抗原中添加高浓度的COS(8 mg/m L,10 mg/m L)能为珍珠龙胆石斑鱼提供良好的免疫保护,并能增强特异性免疫反应。COS作为一种有效免疫增强剂,进一步研究其能否在与Oil和抗原配伍使用情况下能否提供更长久、稳定的免疫保护。免疫8 w后,接种FKC、FKC+COS、FKC+Oil和FKC+Oil+COS的石斑鱼的RPS分别为62%、70%、82%和87%,而对照组(生理盐水和Oil)的RPS为33%和22%,说明FKC中添加Oil+COS能有效增强对石斑鱼的保护效果。ELISA结果表明,接种FKC+Oil+COS疫苗能使抗体滴度上调至最高水平(5 w),抗体滴度为1:512,其次为接种FKC+Oil疫苗(1:512),而接种FKC仅为1:256。同时,血清总蛋白含量、LZM、CAT和SOD活性也出现不同程度被增强,最高值均出现在接种FKC+Oil+COS疫苗的石斑鱼组内。另外,接种疫苗后能使各组石斑鱼的肝脏、脾脏、肾脏及胸腺组织中Ig M、IL-1β、TNF-α、My D88、CD8α和MHCIα等免疫基因在不同时刻出现不同程度表达上调。其中,接种FKC+Oil+COS疫苗,能使石斑鱼肝脏、脾脏、肾脏和胸腺组织中Ig M和IL-1β、肝脏和肾脏组织中TNF-α、脾脏、肾脏和胸腺组织中CD8α的表达至最高水平,而接种FKC+Oil疫苗则对实验鱼的脾脏和胸腺组织中TNF-α、胸腺组织中My D88、肝脏组织中CD8α、肝脏、脾脏、肾脏和胸腺组织中MHC-?α的表达更具优势,表明接种疫苗能使免疫因子在免疫组织中呈现不同表达水平,且受疫苗类型影响。综上所述,珍珠龙胆石斑鱼接种哈维氏弧菌灭活疫苗能改善机体免疫力,与佐剂配伍使用时可以提供良好的免疫保护效果。COS作为一种免疫增强剂,能有效抵哈维氏弧菌的感染,且依赖于其浓度。而当COS和Oil共同作为FKC疫苗佐剂时,能长时间、稳定地增强特异性与非特异性免疫反应,从而提高对石斑鱼的免疫保护。因此,COS是一种潜在、优质地水产疫苗免疫增强剂。