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水稻是世界上最重要的粮食作物之一。水稻的生育期内经常会遇到淹水胁迫等无氧或低氧环境,进行无氧呼吸。无氧呼吸主要有酒精发酵、乳酸发酵和丙氨酸发酵。乳酸发酵是丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下脱氢产生乳酸。乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)可以催化乳酸和丙酮酸之间的相互转化。根据催化底物——乳酸构型的不同,可以分为L-LDH和D-LDH两种类型；根据电子受体不同,又可以分为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotine amide adenine dinucleotide, NAD)依赖和细胞色素C依赖的乳酸脱氢酶两种组别。它们在真细菌、古细菌和真核生物中都广泛存在,具有重要的生物学功能。本研究通过生物信息学分析,克隆了一个水稻细胞色素C依赖的D-乳酸脱氢酶,通过原核表达纯化鉴定其酶学动力特征,并对其在水稻各组织中的表达模式、亚细胞定位等进行了分析；通过农杆菌介导的遗传转化法,成功获得RNAi干扰转基因株系并进行了功能鉴定,获得的主要结果如下：1.基因克隆：通过生物信息学分析,从籼稻9311中成功克隆全长D-LDH cDNA,该基因位于7号染色体短臂端,在基因组中为单拷贝,属于一种FAD结合蛋白；测序发现,OsD-LDH存在多种可变剪接方式,以其中两种为主,分别命名为OsD-LDH-1和OsD-LDH-2。OsD-LDH-1编码框全长795bp,编码254个氨基酸,是一个截短的蛋白。OsD-LDH-2编码框全长1686bp,编码561个氨基酸,是全长蛋白,他们拥有相同的N端序列。2.保守性和进化分析：OsD-LDH-2的氨基酸序列同拟南芥D-LDH (AtD-LDH)具有69.8%的一致性,79.5%的相似性；与酿酒酵母D-LDH (ScD-LDH)具有18.2%的一致性,25.3%的相似性；与大肠杆菌D-LDH(EcD-LDH)具有13.7%的一致性,20.5%的相似性；系统进化分析显示D-LDH广泛存在于原核生物和和真核生物中；3.酶活及动力学特征：通过原核表达纯化,成功获得融合OsD-LDH-2-GST蛋白。酶学活性分析表明,OsD-LDH-2-GST以细胞色素C作为电子受体,主要催化D-乳酸和D-2-羟基丁酸脱氢,其中催化D-2-羟基丁酸的最大反应速度比D-乳酸约高50%,Km约为D-乳酸的一半；并具有微弱的催化L-乳酸脱氢,不具有催化乙醇酸脱氢活性。OsD-LDH-1则几乎没有活性。4.亚细胞定位分析：OsD-LDH编码框不同部位与GFP融合表达,通过转化原生质体或转基因鉴定定位位置,Confocal观察结果表明OsD-LDH定位于线粒体中,其定位信号位于N端40个氨基酸序列内。5.组织表达分析：以籼稻9311为材料,对其不同组织和不同发育时期OsD-LDH的表达模式进行qRT-PCR分析,结果表明,OsD-LDH在剑叶中表达量最高；在叶鞘和萌发期的种子中表达量也较高,在其它组织中表达量都较低；OsD-LDH在灌浆早期(开花后1-10天)表达呈逐渐上升态势。其表达模式与OsL-LDH不同。qRT-PCR分析非生物胁迫和激素处理9311幼苗cDNA发现OsD-LDH对热处理和GA、SA、IAA和6-BA有较强响应,而OsL-LDH响应模式与此不同。6.获得干扰转基因株系：构建了OsD-LDH干扰载体,通过农杆菌介导的遗传转化粳稻中花11,获得了33个独立转基因株系并进行了初步鉴定,基因组PCR鉴定,30个转基因株系均为阳性；RT-PCR分析证实12个株系中OsD-LDH表达明显下降。7.功能分析表明OsD-LDH不参与光呼吸作用途径,推测也不参与厌氧代谢产生的乳酸消除。丙酮醛处理条件下,RNAi转基因株系生长严重受阻,体内丙酮醛含量升高,总谷胱甘肽含量下降,还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽比例下降,乙二醛酶系统活性发生变化。因此,推测OsD-LDH参与丙酮醛代谢途径,可能主要是通过消除乙二醛酶系统产生的D-乳酸从而促进乙二醛酶系统对丙酮酸脱毒。此外,OsD-LDH还参与盐胁迫响应。