水稻白叶枯病(Bacterial Blight)是世界性的水稻病害,特别是在亚洲尤其严重,我国是发病比较严重的地区之一,大流行的年分造成水稻严重减产,威胁粮食生产安全。防治该病最好的方法是种植抗病水稻品种。但大部分水稻品种仅仅抵抗该病某些亚群病原物的侵害。所以水稻生产中,要求科学合理的进行品种布局。而合理的品种布局的前提条件是,掌握病原物的毒性特点和地理分布及演化规律。由于我国近年大面积推广抗病品种,水稻白叶枯病基本上得到控制,已经不是水稻的主要病害,但在局部稻区还有零星发生。科学家预言该病现阶段在中国处于“静默期(silent stage)",所以不能掉以轻心,该病应该始终处于人们的监控之中。水稻白叶枯菌存在致病力的分化现象,也就是存在致病小种的现象,这是水稻品种布局的主要原因。方中达等,1990年最早报道了我国的水稻白叶枯菌小种(pathotype致病型)的情况,用遗传背景不同的五个传统水稻品种作为鉴别寄主把我国的水稻白叶枯菌划分为7个小种(致病型)。他的方法和划分的小种的代表种在以后的抗病育种和生产实践中有广泛的应用。十多年过去了,我国的水稻白叶枯菌的小种又有何特点呢?目前用含有已知抗病基因的近等基因系水稻品种对我国水稻白叶枯菌致病力分化研究的报道还比较少。用近等基因系水稻品种来研究病菌小种毒性,不但能反应小种的毒性特点,而且便于比较分析研究。本研究用2003年采集的,来自全国12个省主要稻区的103个水稻白叶枯菌在30个水稻品种上的毒性试验,其中包括以IR24为轮回亲本的13个近等基因系品种,来分析我国菌株的毒性多样性。发现水稻品种IRBB3(Xa3)和IRBB4(Xa4)对50%以上的测试菌感病,而它们所含的抗病基因Xa3和Xa4是传统品种中广泛利用的抗病基因。近等基因系品种IRBB21(Xa21)拥有最广的单基因抗性谱。IRBB50(Xa4+xa5)和IRBB54(xa5+Xa21)是抗病表现最好的双抗病基因组合的品种。传统品种DV85抗所有的测试菌,IR26和BJ1对90%以上的测试菌有抗性.Javal4和Asminori对50%以上的测试菌感病。在13个近等基因系中,没有发现对所有菌株都有抗性的品种,在103个测试菌株中,也没有发现对所有13个近等基因系都致病的菌株。以IR24为轮回亲本的13个近等基因系把测试菌株分成61个致病型,大部分菌株的致病型各不相同,拥有相同致病型的菌株比较少,根据致病型的相似性,61个致病型可聚成4个类群(Cluster),聚类群2是优势群,分布最广。云南菌株的致病型最多样,含有全部4个聚类群的菌株。其它省含有一到两个类群。另外,还发现我国有的白叶枯菌株丧失了在烟草上的非寄主过敏反应能力。至今世界上用不同的鉴别品种鉴定了30多个水稻白叶枯小种。由于所用鉴别品种不同,所以一定程度上限制了所鉴定小种的国际比较研究。水稻-白叶枯菌互作符合典型的基因对基因关系,基于近等基因系的毒性分析为病原小种的鉴定提供了独一无二的工具,也为生产提供了依据,但是这种毒性分析产生的信息,并不能有效地反应病原物的遗传多样性和进化演变规律。对白叶枯菌又不能从形态学、生理学和生化差异进行区分,幸运的是分子标记技术的出现为病原物的种群遗传结构研究提供了丰富的分子标记,如RFLP.转座子、基于PCR技术和插入序列元件等,这些技术已经被成功地用来分析病原物的种群结构和遗传进化关系。已有研究报道Xoo的avrBs3/pthA基因家族成员在核酸序列上有很显著的特点,如有高度同源的5’和3’端,有保守的Bam HI和Sph I酶切位点,有数目不等的几乎一样的长度为102bp的重复序列,这种遗传特征为研究病原的种群结构提供了机会。本研究尝试对avrBs3/pthA基因家族多样性的成员进行研究,来揭示我国Xoo的种群遗传特点。本研究用avrXa3的Sph I片段(1376bp)作探针,与来自我国12个省的52个水稻白叶枯菌株(从致病性测试的103个菌中选出)的基因组在Sph I酶切后作RFLP杂交,发现探针的同源片段主要集中在1000bp到5000bp这个区间,意味着我国Xoo的avrBs3/pthA基因家族成员含有的102bp的重复数大约有9-50个,每个菌株有12-25个同源拷贝,平均有16个。RFLP图谱中发现有长度为1.8Kb.2.1Kb和2.6Kb的三条带是所有测试菌共有的,包括两个细条菌,此外1.3Kb的条带是Xoo特有的。因此推断这些共有的条带是始原的和保守的,其它的条带是由这些条带演化而来。这种演化过程可能就是avrBs3/pthA基因家族的演化过程或我国白叶枯病菌的演化过程。52个参试菌中根据杂交带型共鉴定了42种RFLP分子型(haplotype),根据分子型的相似性分为4个系群(Lineage).云南菌株的遗传多样性最高,含有全部4个系群,其余各省含有一或两个系群。这说明我国的水稻白叶枯菌株存在高度的遗传多样性。另外,发现致病型和分子型至少存在两种关系,拥有相同致病型的菌株却有不同的分子型,而有相同分子型的菌株也有不同的致病型。要有效利用寄主的抗病性,就必须先理解寄主植物的抗病机理。克隆和鉴定病原细菌的无毒基因对理解水稻的抗病机理和生产实践都有重要意义。分析已经完成全基因组序列测定的三个白叶枯菌KACC10331.MAFF311018和PX099A,发现分别有15、17和19个avrBs3/pthA基因家族成员,至今已经有4个水稻白叶枯avrBs3/pthA基因家族的无毒基因成员被克隆鉴定,分别是avrXa7,avrXa10,avrXa3和avrXa27,还有若干毒性基因被鉴定,例如pthXo1,pthXo2,pathXo3等。根据本文的研究结论,在Xoo中至少还有一半avrBs3/pthA基因家族的成员未被鉴定和认识。本研究用无毒基因avrXa3的长度为1376bp的SphI片段为探针,通过菌落原位杂交,从JXOV的基因文库(粘粒pHM Ⅰ为载体构建)筛选得到29个阳性克隆。根据这29个克隆的Bam HI酶切的Southern杂交图谱,发现基于EcoR Ⅰ片段构建的JXOV的文库克隆,大多由2-6个直接或间接串联的a vrXa3的同源片段组成,依据Bam HⅠ酶切图谱中条带的大小和位置关系,挑选10个克隆,电转化强毒性中国受体菌株KS6-6A (KA)和弱毒性中国受体菌株OS198A (OA),剪叶接种实验表明,2号克隆的转化子能使受体菌KS6-6A(KA)在水稻品种IRBB4上的病斑明显缩短。它的Bam H I酶切图谱表明,它含有4个无毒基因同源片段。分别Bam H I酶切、回收,然后连接在测序载体pUC19上,测序和NCBI的比对结果表明,其中三个亚克隆片段B17(FJ176907), D82(FJ176908)和D41(FJ176909)是avrBs3/pthA基因家族的新成员。亚克隆片段B17,D82和D41长度分别为2131bp,3346bp和4482bp,分别含有5.6,16.4和26.3个102bp的重复区。把这三个亚克隆片段分别连接在粘粒载体pHMI上,然后电转化受体菌KS6-6A(KA)和PX099A(PA),剪叶接种13个近等基因系表明,三个亚克隆片段的转化子PB17(pHM I::B17)、PD82(pHM I::B82)和PD41(pHM I::B82)均使受体菌PX099A在13个近等基因系上的病斑变短。而以KA为受体菌的亚克隆B17的转化子KB17,它的两个克隆KB1716和KB1717均能能造成与受体菌KS6-6A(KA)一样的在12个水稻品种上无显著差别的病斑长度和在IRBB7上变长的病斑。说明相同的无毒基因B17在不同的遗传背景[即在不同的受体菌中KS6-6A (KA)和PX099A(PA)]下有不同的功能,即它们使受体菌在水稻上的病斑变短或没有变化。没有发现特异的专化性的菌和水稻一对一的病斑变短现象。植物和病原物的互作分为亲和性互作与非亲和性互作。抗病基因(Resistance gene, R)和无毒基因(avirulence gene, avr)识别后,才能产生非亲和反应,这时植物会诱发特征性的防御反应。而在亲和性互作中,一般很少发生,即使有,反应的强度和时间都相对滞后。侵染处的细胞会发生过敏性细胞死亡,以延缓或抑制病菌的生长和扩散。同时,源于侵染处的信号分子能诱导植物的其余部分产生局部获得抗性(local acquired resistance, LAR)或系统获得抗性(system acquired resistance, SAR),以防止病菌的扩散和植株再次感染。这是因为avr-R识别后的信号传递激活了包括活性氧的生成的各类防卫反应。研究表明活性氧参与细胞壁的木质化及有关蛋白质与细胞壁的交联,使细胞壁加强(Reinforce),从而使病原物的侵入减慢,活性氧迸发(oxidative burst)被认为是过敏反应(Hypersensitive response, HR)的特征性反应,也是植物对病原菌应答的最早期反应之一。根据本文研究结果,K2(KS6-6A/pHMI::2)介导的Xoo-水稻互作表型中,可能是诱导启动了水稻IRBB4植株的防卫反应系统.因此本研究选择活性氧爆发、细胞壁的加固和Xoo的生长动态这三个指标,来观察K2及其三个亚克隆B17、D82和D41的菌株在启动水稻防卫系统后的抗病表型。研究发现,两周苗龄的水稻IRBB4植株,在注射接种接种16个Xoo,分别是JXOV, KS-66A (KA), KS6-6A/pHMⅠ(KP), KS6-6A/pHM Ⅰ::2(K24), PX099A (PA), PX099A/pHMⅠ(PP), PX099A/pHMⅠ::2(P27), KA/pHM Ⅰ::B1716(KB1716), KA/pHM Ⅰ (KB1717), KA/pHM Ⅰ::D4118(KD4118), PA/pHM Ⅰ::B172(PB172), PA/pHM Ⅰ (PB174), PA/pHMⅠ::D823(PD823), PA/pHM Ⅰ:ID825(PD825), PA/pHM Ⅰ (PD411)和PA/pHM Ⅰ::D413(PD413),灭菌自来水作无菌空白对照,通过连续四天观察发现,第一天出现了不明显的水渍症状,没有氧迸发现象,但是从第二天开始,水稻植株出现典型的水渍状症状,并观察到氧迸发现象,而且在第三天和第四天这些现象更加明显,但主要集中在接种区域,而灭菌自来水处理始终没有观察到氧迸发现象。两周苗龄的水稻IRBB4植株在接种灭菌自来水、KS-66A(KA)、KS6-6A/pHMⅠ (KP)、 KS-66A/pHMⅠ::8(K8)、KS-66A/pHM Ⅰ::2(K2)后取第三天的叶片做石蜡切片观察木质素积累现象,发现接种区出现无差别的木质化现象,接种区的邻近区域则没有出现木质化现象,木质化现象仅仅局限在接种区域的维管束部分。一个月苗龄的水稻IRBB4植株,在剪叶接种上述菌株(与注射接种的菌相同)后,通过连续4天测定,发现它们均有相同的生长趋势,但是对照菌KS-66A (KA), PX099A (PA), KS6-6A/pHM Ⅰ(KP)知PX099A/pHMⅠ(PP)的菌体生长快,浓度最高,而含有avrBs3/pthA成员片段的B17,D82和D41的转化子生长滞后,在水稻IRBB4植株上的浓度最低。