论文部分内容阅读
糖尿病是一种以高血糖为特征的非传染性慢性代谢性疾病,其中2型糖尿病占比高达90%。持续的高血糖导致代谢紊乱,引发肝、肾、心脏等多个器官的疾病,其中以非酒精性脂肪肝病最为常见。2型糖尿病患者中同时患有非酒精性脂肪肝病的比例约47.3-63.7%,如果不加以控制,肝脂肪变性会发展为非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞肝癌。与单纯2型糖尿病或其他非酒精性脂肪肝病相比,2型糖尿病并发/合并非酒精性脂肪肝病的发病机制更为复杂,仅针对2型糖尿病或非酒精性脂肪肝病的临床治疗的疗效不佳。因此,深入研究2型糖尿病脂肪性肝病的发病机制,将为临床治疗提供新策略。2型糖尿病患者肝脏中甘油三酯和总胆固醇的过度沉积引发的肝脏脂肪变性是非酒精性脂肪肝病的初始阶段,其发生肝脏脂肪变性的分子机制尚未完全清楚,而自噬作为一种高度保守的自我保护机制,已被证明在脂质代谢和肝脏脂肪变性方面发挥重要作用,但其在2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病中的作用及分子机制并不明确。Micro RNAs与非酒精性脂肪肝病中的脂质代谢和胰岛素抵抗等关系密切,它作为一种非编码核苷酸,通过与靶m RNA的3’-UTR不完全配对调控该基因的表达。有报道,miR-690可显著改善高脂饮食小鼠的胰岛素抵抗,降低血糖,其机制可能与靶向Nadk调节巨噬细胞炎症和胰岛素信号转导有关,但其对糖尿病肝脏脂肪变性的影响及其与自噬的关联未见报道。本研究采用2型糖尿病db/db小鼠模型和高糖诱导NCTC1469细胞体外损伤模型模拟2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病,探讨miR-690对糖尿病肝细胞脂肪变性的作用,并明确其机制是否与调控肝细胞自噬有关。该研究结果将为2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病临床治疗和新药开发提供新的靶点。第一部分:miR-690对糖尿病db/db小鼠肝脏脂肪变性的作用观察目的:观察自发性2型糖尿病db/db小鼠肝脏组织中miR-690、15-LOX和NF-Kappa B P65的表达变化;给予miR-690 agomir（miR-690类似物）,观察miR-690对db/db小鼠肝脏脂肪变性损伤和肝细胞自噬的作用,以及对15-LOX和NF-Kappa B P65蛋白水平的影响。方法:1.生物信息学预测Targetscan、DIANA-micro T、miRDB和miRWalk等生物信息学预测网站预测miR-690同15-LOX以及NF-Kappa B P65的潜在结合位点。2.实验分组及处理（1）db/db小鼠肝脏组织miR-690、15-LOX以及NF-Kappa B P65表达变化观察:小鼠分为正常组（db/m）和模型组（db/db）,n=4。（2）miR-690 agomir对db/db小鼠肝脏脂肪变性的作用观察:小鼠分为正常组（db/m）、模型组（db/db）,模型+阴性对照组（db/db+NC）和模型+agomir组（db/db+agomir）,n=6。db/db+NC组和db/db+agomir组小鼠每周分别经尾静脉注射miR-690 agomir-NC和miR-690 agomir,持续4周。观察指标与检测方法:测定db/db小鼠不同周龄体质量和随机血糖;OGTT实验检测小鼠葡萄糖耐量;测定db/db小鼠肝湿重和肝指数;生化酶学法测定db/db小鼠血清脂质指标（LDL-C、T-CHO、TG）和肝功能指标（血清AST和ALT）等变化;Elisa法测定db/db小鼠血清胰岛素水平;HE染色观察db/db小鼠组织病理学改变;油红O染色观察db/db小鼠肝脏脂肪变性程度;NAS评分评价db/db小鼠肝脏NAFLD活动度;PAS染色观察db/db小鼠肝脏糖原储存能力;免疫荧光法检测db/db小鼠肝脏组织中LC3B表达;透射电镜观察db/db小鼠肝脏组织中自噬小体数目;RT-q PCR法检测db/db小鼠肝脏miR-690与15-LOX m RNA表达;WB法检测db/db小鼠肝脏15-LOX、NF-Kappa B P65、LC3B、P62、Beclin1、p-m TOR（Ser2448）和m TOR的蛋白表达。结果:1.15-LOX m RNA的3’-UTR和miR-690的种子区域和有一段互补结合位点,为第286-292位碱基;NF-Kappa B P65 m RNA的3’-UTR同miR-690的种子区域有两段互补配对结合位点,分别为第295-318位碱基和第628-651位碱基。2.与db/m组小鼠相比,db/db组小鼠体质量、随机血糖和口服糖耐量显著升高（P＜0.01＆P＜0.01＆P＜0.01）;肝脏湿重和肝指数明显升高（P＜0.01＆P＜0.01）;血清LDL-C、T-CHO、TG、胰岛素、AST和ALT水平显著升高（P＜0.05＆P＜0.01＆P＜0.05＆P＜0.01＆P＜0.01＆P＜0.01）;肝细胞死亡率和NAS评分显著升高（P＜0.01＆P＜0.001）;肝脏油红O阳性染色面积明显增加（P＜0.01）,肝脏糖原阳性染色面积明显减少（P＜0.01）;肝细胞胞浆LC3BII荧光强度显著降低（P＜0.01）;肝细胞自噬小体数目明显减少（P＜0.01）;肝脏miR-690水平显著降低（P＜0.01）,15-LOX m RNA显著升高（P＜0.01）;肝脏15-LOX和NF-Kappa B P65蛋白水平显著增加（P＜0.01＆P＜0.01）;LC3B II/I比值和Beclin1的蛋白明显下调（P＜0.01＆P＜0.01）,p-m TOR（Ser2448）/m TOR比值和P62蛋白水平显著升高（P＜0.05＆P＜0.01）。3.与db/db+NC组比较,db/db+agomir组小鼠体重无显著性差异（P＞0.05）;随机血糖、口服糖耐量、肝脏湿重和肝指数显著降低（P＜0.01＆P＜0.05＆P＜0.05＆P＜0.05）;血清LDL-C、T-CHO、胰岛素、AST和ALT水平明显降低（P＜0.05＆P＜0.05＆P＜0.05P＜0.05＆P＜0.05）,血清TG降低但无统计学差异（P＞0.05）;肝细胞死亡率和NAS评分显著降低（P＜0.05＆P＜0.01）;肝脏油红O阳性染色面积明显减少（P＜0.05）;肝脏糖原阳性染色面积明显增加（P＜0.05）;肝细胞自噬小体数目和胞浆LC3BII荧光强度显著增加（P＜0.01＆P＜0.05）;肝脏miR-690水平显著升高（P＜0.01）,15-LOX和NF-Kappa B P65蛋白水平明显降低（P＜0.05＆P＜0.05）;LC3B II/I比值和Beclin1的蛋白水平明显升高（P＜0.05＆P＜0.05）,p-m TOR（Ser2448）/m TOR比值和P62蛋白水平显著降低（P＜0.05＆P＜0.05）。结论:（1）糖尿病db/db小鼠肝脏miR-690水平明显降低、15-LOX m RNA和蛋白,以及NF-Kappa B P65蛋白表达明显增加。（2）糖尿病db/db小鼠血糖和血脂明显升高,胰岛素抵抗,肝功能明显异常肝细胞坏死和脂质病理性累积,肝细胞自噬被显著抑制。（3）miR-690对db/db小鼠肝脏脂肪变性损伤有明显的保护效应,其机制可能与调控15-LOX和NF-Kappa B P65表达、激活自噬有关。第二部分:miR-690对高糖诱导NCTC1469细胞损伤的作用观察目的:观察高糖处理NCTC1469细胞miR-690、15-LOX和NFKappa B P65的表达变化;miR-690 mimic/inhibitor对高糖处理NCTC1469细胞活力、细胞脂质累积、葡萄糖摄取能力以及细胞自噬的影响;采用miR-690 mimic分别与15-LOX和NF-Kappa B P65过表达联合干预、双荧光素酶基因报告实验初步探讨miR-690对高糖诱导NCTC1469细胞损伤作用的机制。方法:1.高糖诱导的NCTC1469细胞损伤模型的建立:含55.5 m M D-葡萄糖的高糖培养基处理NCTC1469细胞48 h。2.实验分组（1）miR-690、15-LOX和NF-Kappa B P65在高糖刺激NCTC1469细胞中的变化观察:NCTC1469细胞分为正常组（NG）和模型组（HG）,n=4。（2）miR-690对高糖诱导NCTC1469细胞损伤的作用观察:NCTC1469细胞分为正常组（NG）、模型组（HG）、模型+mimic-阴性对照组（HG+mimic-NC）、模型+mimic-50 n M组（HG+mimic）、模型+inhibitor-阴性对照组（HG+inhibitor-NC）和模型+inhibitor-100n M组（HG+inhibitor）,n=4。miR-690 mimic-NC、miR-690 inhibitorNC、miR-690 mimic和miR-690 inhibitor分别于造模前24 h给予。（3）miR-690 mimic与15-LOX过表达联合干预对高糖诱导NCTC1469细胞损伤的作用观察:NCTC1469细胞分为正常组（NG）、模型组（HG）、模型+mimic-阴性对照组（HG+mimic-NC）、模型+mimic-50 n M组（HG+mimic）、模型+空载病毒组（HG+LV-NC）、模型+15-LOX过表达慢病毒组（HG+LV-LOX）和模型+mimic-50n M+15-LOX过表达慢病毒组（HG+mimic+LV-LOX）,n=4。空载病毒和15-LOX过表达慢病毒分别于细胞造模前72 h给予。（4）miR-690是否直接结合15-LOX的3’-UTR观察:HEK-293T细胞分为15-LOX-3’-UTR野生型+miR-690阴性对照组（Alox15WT+NC）、15-LOX-3’-UTR野生型+miR-690 mimic组（Alox15WT+miR-690）、15-LOX-3’-UTR突变型+miR-690阴性对照组（Alox15 MUT+NC）、15-LOX-3’-UTR突变型+miR-690 mimic组（Alox15 MUT+miR-690）,n=3。（5）miR-690与NF-Kappa B P65过表达联合干预对高糖诱导NCTC1469细胞损伤的作用观察:NCTC1469细胞分为正常组（NG）、模型组（HG）、模型+mimic-阴性对照组（HG+mimic-NC）、模型+mimic-50n M组（HG+mimic）、模型+空载质粒组（HG+NC）、模型+NF-Kappa B P65过表达质粒组（HG+pc DNA）和模型+mimic-50n M+pc DNA组（HG+mimic+pc DNA）,n=4。空载质粒和NFKappa B P65过表达质粒分别于细胞造模前24 h给予。3.观察指标与检测方法:MTT法检测NCTC1469细胞活力;油红O染色检测细胞脂质沉积;2-NBDG检测细胞对葡萄糖的摄取能力;stub RFP-GFP-LC3慢病毒观察NCTC1469细胞自噬流变化;RTq PCR检测miR-690和15-LOX m RNA表达变化;WB检测15-LOX、NF-Kappa B P65、p-m TOR（Ser2448）、m TOR、LC3BII/LC3BI、P62和Beclin1蛋白的表达改变;双荧光素酶基因报告分析miR-690是否与15-LOX的3’-UTR互补配对位点直接结合。结果:1.与NG组相比,HG组NCTC1469细胞中miR-690表达显著降低（P＜0.01）,15-LOX m RNA、15-LOX和NF-Kappa B P65蛋白表达显著升高（P＜0.01＆P＜0.01＆P＜0.01）;肝细胞活力明显降低（P＜0.01）;油红O阳性染色面积明显增加（P＜0.01）;胞浆2-NBDG荧光强度降低;细胞内自噬溶酶体数目（RFP+/GFP-）较自噬小体数目（RFP+/GFP+）明显减少（P＜0.05）;p-m TOR（Ser2448）/m TOR比值、P62蛋白水平明显升高（P＜0.05＆P＜0.05）,LC3BII/LC3BI比值和Beclin1蛋白水平显著下降（P＜0.05＆P＜0.05）。2.与HG组相比,HG+mimic组细胞胞浆2-NBDG荧光强度增加;油红O阳性染色面积明显减少（P＜0.05）;肝细胞内自噬溶酶体数目（RFP+/GFP-）较自噬小体数目（RFP+/GFP+）显著增加（P＜0.05）;与HG组相比,HG+inhibitor组胞浆2-NBDG荧光强度和油红O阳性染色面积无明显变化;细胞自噬溶酶体数目（RFP+/GFP-）较自噬小体数目（RFP+/GFP+）没有统计学差异。3.与HG+mimic-NC组相比,HG+mimic组NCTC1469细胞活力明显增加（P＜0.05）;15-LOX m RNA表达水平显著下调（P＜0.05）;p-m TOR（ser2448）/m TOR比值、P62、15-LOX和NF-Kappa B P65蛋白水平明显下调（P＜0.05＆P＜0.05＆P＜0.05＆P＜0.05）,Beclin1蛋白水平以及LC3BII/LC3BI比值明显升高（P＜0.05＆P＜0.05）。与HG+inhibitor-NC组相比,HG+inhibitor组细胞活力明显降低（P＜0.05）;15-LOX m RNA表达显著上调（P＜0.05）;LC3BII/LC3BI比值、p-m TOR（ser2448）/m TOR比值、P62、Beclin1、15-LOX和NF-Kappa B P65蛋白水平无显著性差异（P＞0.05）。4.与HG+mimic组相比,HG+mimic+LV-LOX组NCTC1469细胞15-LOX、P62蛋白以及p-m TOR（ser2448）/m TOR比值显著升高（P＜0.05＆P＜0.05＆P＜0.05）,而LC3BII/LC3BI比值明显降低（P＜0.05）。5.与HG+mimic组相比,HG+mimic+pc DNA组NCTC1469细胞活力显著下调;NF-Kappa B P65蛋白、p-m TOR（ser2448）/m TOR比值和P62蛋白显著升高（P＜0.05＆P＜0.05＆P＜0.05）,而LC3BII/LC3BI比值显著降低（P＜0.05）。6.双荧光素酶基因报告结果中,与Alox15-WT+miR-NC组相比,Alox15-WT+miR-690组细胞的荧光值无明显统计学差异（P＞0.05）。结论（1）高糖刺激会导致NCTC469肝细胞损伤,脂质沉积,葡萄糖摄取能力减弱,NF-Kappa B P65和15-LOX表达增加,自噬水平受到抑制。（2）miR-690可明显改善高糖诱导NCTC469肝细胞损伤,并下调NF-Kappa B P65和15-LOX表达激活肝细胞自噬。（3）miR-690对高糖诱导NCTC469肝细胞损伤的保护作用机制,可能涉及非直接靶向下调15-LOX表达,以及直接靶向下调NFKappa B P65表达,进而激活肝细胞自噬。