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玉米是全球广泛种植的主要粮食作物。玉米起源于位于热带的墨西哥西南部,是由大刍草驯化而来的,属于短日照作物,对光周期敏感,限制了热带种质资源的应用。基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术为快速改善玉米对光周期的敏感性进而改良玉米的开花期提供了可能。本研究以光周期敏感基因ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7三个基因为靶向基因,利用CRISPR/Cas9技术与胚特异性表达的DsRed荧光筛选系统靶向编辑上述三个基因,改良了四份玉米材料的目标基因。主要结果如下:1.以KN5585、CML312SR、LCL-1、LCL-2四份玉米材料为受体,其中,KN5585为稳定转化受体,CML312SR、LCL-1、LCL-2为预改良的晚熟材料受体。四个受体材料目标区域测序结果表明3个靶基因ZmCCT10、ZmCCT9和ZmGhd7基因目标区域序列是保守的。该结果为后续定点突变的设计奠定了序列分析基础。2.设计用1个单分子指导RNA(single-guide RNA,sgRNA)复合编辑ZmCCT10、ZmCCT9和ZmGhd7基因,并构建了稳定转化的基因编辑定向基因敲除载体CCT-CPD,载体上具有Ubi启动子驱动的Cas9表达盒,U6启动子驱动的sgRNA表达盒,CaMV 35S(enhanced)启动子驱动的Bar筛选标记表达盒以及P3896启动子驱动的DsRed荧光筛选标记表达盒(胚特异性表达)。3.以玉米自交系KN5585为受体,采用农杆菌转化法同时转化CCT-CPD、CPD-2、CPD-3三个表达载体(本研究仅介绍CCT-CPD表达载体),获得稳定转化受体42个,含有CCT-CPD表达载体的有25个转化体,比例为59.5%,其中23个转化体中只含有CCT-CPD表达载体,占阳性转化体54.8%,占含有CCT-CPD表达载体植株的92.0%。通过对T0代与对应的T1代阳性植株的分子鉴定与荧光鉴定,使用农杆菌转化法转化表达载体获得的转化体的转基因元件可稳定遗传。4.对受体材料的鉴定方法有:(1)Sanger测序法,采用Sanger测序法可以鉴定三个基因的突变情况;(2)PCR/RE法,与ZmCCT9和ZmGhd7基因不同,Zm CCT10基因的靶标在PAM上游3个碱基处附近带有常见限制性内切酶BstXⅠ的识别位点,在测序鉴定基因型前,通过酶切法验证,能快速筛选出未突变(即野生型)、杂合突变、纯合突变或双等位突变的材料;(3)荧光筛选,利用胚特异性启动子和DsRed荧光蛋白构建的转化体筛选系统结合手持荧光灯,便于对收获的玉米种子(KN5585自交获得的种子以及晚熟材料与KN5585阳性株杂交获得的F1)进行阴性种子和阳性种子的筛选。5.设计的sgRNA与ZmGhd7基因的靶位点是完全一致的,与ZmCCT10和ZmCCT9基因的靶位点均有一个碱基差异,经过分析发现这三个基因的突变类型存在的形式与突变率是有差异的:(1)17个样品发生ZmCCT10基因的目标突变,且突变位点在PAM上游3-4个碱基处,主要以+1bp的突变形式存在,这些突变体的突变类型与酶切结果保持一致,即2个样品是杂合突变,15个样品是纯合突变或双等位突变,ZmCCT10基因的突变率为68.0%(17/25);(2)有3个样品发生ZmCCT9基因的目标突变,突变类型主要是发生了大片段敲除,ZmCCT9基因的突变率为12.0%(3/25);(3)有11个样品发生ZmGhd7基因的目标突变,以大片段敲除和+(1-2)bp或者-(1-2)bp的突变形式存在,ZmGhd7基因的突变率为44.0%(11/25),编辑活性目前在T0代中表现的较为明显。6.对T0代自交或者测交获得的种子,通过荧光筛选系统获得了阳性种子和阴性种子,并且在阴性材料中鉴定到杂合突变株,该结果便于后续快速得到无转基因纯合突变体。7.通过杂交法,即晚熟材料(♀,母本)与KN5585阳性株(♂,父本)杂交获得F1,并通过荧光筛选系统获得了含有有效基因编辑元件晚熟材料,即胚部有DsRed荧光表达的种子。综上,CRISPR/Cas9技术与胚特异性表达的DsRed荧光筛选系统的结合可有效靶向编辑三个基因,并快速获得相应突变体。