研究背景血管瘤(hemangiomas)是发生在婴幼儿的血管源性良性肿瘤,发病率高达10～12%,绝大多数在出生时或出生后不久发现,大部分可自行消退,但仍有20%的血管瘤不能消退。根据病变发展过程可分为增殖期、消退期和消退完成期。血管瘤虽然属于良性肿瘤,但发生在口腔颌面及颈部的病变,不仅严重影响面容美观,还可能由于病变阻塞呼吸道、消化道而影响发音、进食,甚至导致局部出血、窒息并危及生命。因此目前主张对该病应积极进行早期治疗。血管瘤常用的治疗方法有药物治疗、激光、手术切除、冷冻以及硬化治疗等。冷冻、激光及硬化治疗易导致增生或萎缩性瘢痕、色素沉着或色素减退等,手术切除仅适用于局限性的血管瘤的治疗。药物治疗则是一种治疗早期血管瘤安全、有效的方法。治疗血管瘤的药物有多种,目前国内外常用药物包括以下几类:1.β-肾上腺素受体阻滞剂,以普萘洛尔(propranolol)为主;2.皮质类固醇激素,以泼尼松(prednisolone)为主;3.其它:α-干扰素(IFN-α)、咪喹莫特(Imiquimod)、抗肿瘤药环磷酰胺(CTX)及长春新碱(VCR)等。2008年,在《新英格兰医学杂志》上,Leaute-Labreze C等首次报道口服普萘洛尔引起了鼻咽部血管瘤的消退。近年来,口服普萘洛尔逐渐成为治疗血管瘤的一线药物。2012年,Swetman等首次报道口服西地那非(sildenafil)治疗3名淋巴管畸形患儿后病变显著消退,发表于《新英格兰医学杂志》上,提示西地那非可作为治疗淋巴管畸形的一种新型药物。但该文章仅展示了患儿病变部位的照片和核磁共振平片(magnetic resonance imaging,MRI),病变均未经手术及病理证实为淋巴管畸形。根据MRI表现,我们认为此患儿更符合血管瘤伴发淋巴管畸形的诊断,且病变以血管瘤为主。西地那非是一种磷酸二酯酶-5(phosphodiesterase isoform-5,PDE-5)抑制剂,因而我们推测可能西地那非是通过抑制PDE-5的作用使该病变缩小的。在此启发下,我们通过免疫组织化学的方法研究了 PDE-5在静脉畸形、动静脉畸形、淋巴管畸形、血管瘤组织中的表达。结果表明PDE-5在血管瘤组织中呈阳性表达,在其它脉管畸形组织中无表达。因此,我们认为西地那非是对血管瘤而不是淋巴管畸形起作用。目前很多文献证实西地那非可增强某些类型的恶性肿瘤化疗效果并对血管平滑肌、肺动脉内皮细胞等有抗增殖及促进凋亡的作用。因此,我们通过体外实验进一步研究西地那非对血管瘤内皮细胞(HemECs)增殖及凋亡的影响,并对其相关机制进行探讨。目的1.检测PDE-5在血管瘤及各种脉管畸形组织中的表达。2.研究西地那非对人源性HemECs的增殖和凋亡的影响。3.研究西地那非对HemECs的增殖和凋亡作用与DNA分化抑制因子-1(Id-1)表达的关系,探讨该药的作用机制。方法1.收集山东大学齐鲁医院病理科2000—2013年血管瘤及脉管畸形组织块,通过免疫组织化学的方法分别检测石蜡包埋的10例淋巴管畸形、8例增殖期血管瘤、2例消退期血管瘤、10例静脉畸形以及10例动静脉畸形组织块中PDE-5的表达。血管瘤及脉管畸形的诊断是依据患者病史、体格检查、MRI表现以及最后的病理结果确定的。淋巴管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)、细胞膜表面分化抗原34(CD 34)和葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)分别作为淋巴管内皮细胞、血管内皮细胞和血管瘤组织的特异性标记物。随后对PDE-5在血管瘤及各种脉管畸形组织的表达进行了检测。本研究通过了山东大学齐鲁医院医院伦理委员会授权,所有患者或监护人均知情同意。2.收集山东大学齐鲁医院手术切除并经病理证实为血管瘤组织标本,利用组织块贴壁培养法分离并培养HemECs。通过免疫细胞化学法检测第八因子相关抗原因子vWF、CD 34和PDE-5在HemECs中的表达。体外以梯度浓度西地那非(0μM,1 μM,3 μM,5 μM,10 μM 和 15 μM)处理 HemECs 24 h、48 h 和 72 h后,MTT法检测细胞的增殖能力。以梯度浓度的西地那非(0,1,5,10,15 μM)处理HemECs,20分钟后分别加入50ng/mlbFGF、50ng/mlVEGF。继续孵箱培育24 h。MTT法检测西地那非对bFGF及VEGF诱导的HemECs增殖的影响。HemECs分别经对照组(0 μM)、5 μM西地那非处理24 h后,采用流式细胞Annexin-V/PI staining assay 检测细胞凋亡率。3.组织块培养法获得的HemECs分别经0μM(对照组)、5μM(实验组)西地那非处理24 h后,用TRI法提取细胞总RNA并逆转录成Id-1 cDNA,再通过实时荧光定量RFQ-PCR扩增cDNA,利用比较Ct值法(2-△△Ct)计算Id-l基因和内参照基因阈值循环数差异,检测两组HemECs中Id-1基因的相对mRNA表达量。HemECs分别经0 μM(对照组)、5μ(实验组)西地那非处理24 h后,提取细胞总蛋白,通过免疫印迹法(western blot)检测两组HemECs中Id-1蛋白的表达水平,人舌鳞癌TCA 8113细胞系作为Id-1蛋白表达的阳性对照。结果1.免疫组织化学检测发现CD34、LYVE-I和GLUT-1分别作为血管内皮细胞、淋巴管畸形组织和血管瘤组织的特异性标记物表达均阳性。PDE-5表达在血管瘤组织HemECs胞浆内,但在淋巴管畸形、动静脉畸形、静脉畸形组织中均无表达。2.MTT法检测发现在西地那非浓度为5 μM时,24h后与对照组(0μM)相比开始出现显著差异(t =3.220,P<0.01),出现明显的细胞抑制现象,且随时间延长抑制作用逐渐加强。西地那非作用于HemECs 72 h时细胞的增殖活性与48 h相比无明显差异(P>0.05)。在检测西地那非对bFGF及VEGF诱导的HemECs增殖的抑制作用时,西地那非浓度为5 μ时,对bFGF及VEGF诱导的HemECs增殖也出现明显的细胞抑制现象(P<0.05),且随时间延长抑制作用逐渐加强。然而,当西地那非浓度为15 μM时,与浓度为10 μM相比对HemECs的增殖抑制作用无明显差别(P>0.05)。因此,浓度为5 μM和作用时间为24 h分别是西地那非抑制HemECs的最适有效浓度和最适有效作用时间。用5 μM西地那非处理HemECs 24 h后,在光学显微镜下可见到HemECs随着细胞间连接的破坏和胞浆内不断增加的颗粒,细胞形态发生了改变。流式细胞学分析结果表明5 μM西地那非处理HemECs 24 h后凋亡率为10.5%,高于对照组(2.53%)。因此,体外实验中浓度5 μM的西地那非处理24 h后显著抑制了 HemECs的增殖并促进了其凋亡。3.通过实时荧光定量RFQ-PCR方法,根据2-△△Ct公式,用5μM西地那非处理HemECs 24 h后,细胞内Id-1的mRNA相对表达量减少了 44.2%,(t = 9.749,df=4,P = 0.0006<0.01)。根据Western blot实验取得的免疫印迹条带的灰度值比较分析,用5 μM西地那非处理HemECs 24 h后,细胞内Id-1的蛋白表达也降低。结论1.血管瘤组织中存在磷酸二酯酶-5。2.西地那非在体外能抑制HemECs增殖和促进其凋亡。3.西地那非抑制HemECs增殖和促进其凋亡作用可能是通过下调Id-1基因来实现的。