【摘 要】
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5α-雄甾-4-烯-3,17-二酮（5α-AD）作为合成美雄诺龙、美睾酮、美替诺龙等数十种甾体激素类药物的关键中间体,具有重要的市场价值和研究前景。目前工业上主要以雄甾-4烯-3,17-二酮（AD）经过一系列的化学反应制得,存在着反应途径长、环境污染大、底物昂贵等问题。生物转化法具有绿色、高效的特性,正成为许多化学药物和医药中间体化学合成工艺的替代技术。本论文通过基因筛选和分子生物学手段,结合辅因
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5α-雄甾-4-烯-3,17-二酮（5α-AD）作为合成美雄诺龙、美睾酮、美替诺龙等数十种甾体激素类药物的关键中间体,具有重要的市场价值和研究前景。目前工业上主要以雄甾-4烯-3,17-二酮（AD）经过一系列的化学反应制得,存在着反应途径长、环境污染大、底物昂贵等问题。生物转化法具有绿色、高效的特性,正成为许多化学药物和医药中间体化学合成工艺的替代技术。本论文通过基因筛选和分子生物学手段,结合辅因子再生技术,构建一株以廉价植物甾醇（PS）为底物一步生物转化合成5α-AD的工程菌株,并对其转化工艺进行了优化。通过文献调研及NCBI数据库查找,筛选出来源于齿垢密螺旋体的5α-还原酶基因,并人工合成符合分枝杆菌密码子偏好性的基因序列。以实验室前期构建好的敲除了 3-甾酮-Δ1-脱氢酶（ksdd）的分枝杆菌（MNR M3Δksdd）为宿主细胞,将5α-还原酶与穿梭质粒pMV261连接并克隆至宿主细胞,成功构建了重组工程菌株MNR M3Δksdd/pMV261-5α。以构建好的工程菌株MNR M3Δksdd/pMV261-5α进行甾醇转化实验,并对转化产物进行了分离纯化和结构鉴定。通过薄层色谱（TLC）、高分辨质谱（MS）、核磁（NMR）等实验证实了纯化产物为5α-AD。基于辅因子再生技术,将5α-还原酶分别与辅因子再生的关键酶:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）和NAD激酶串联表达于主产AD的分枝杆菌中,成功构建辅因子再生菌株 MNR M3Δksdd/pMV261-5α-G6PDH2 和 MNR M3Δksdd/pMV261-5α-NAD2。与重组菌株MNR M3Δksdd/pMV261-5α-NAD2相比,在分枝杆菌中串联表达G6PDH更好地实现了 AD到5α-AD反应过程中还原型辅酶Ⅱ（NADPH）再生。建立了 5α-AD的高效转化工艺。最后基于介质工程和生物反应工程的原理和技术对分枝杆菌工程菌株转化PS生产5α-AD的工艺进行优化。当接菌量为8%,底物浓度为3g/L,补糖时间为第4d,补糖浓度为20g/L时,5α-AD摩尔转化率达到最高,为86.41%。这是首次利用生物法来实现从PS到5α-AD的一步转化,为工业上生产5α-AD提供了工程菌株,也为生物催化法生产其他化学法难以合成的高价值化合物提供了借鉴。
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