解淀粉芽孢杆菌阿魏酸酯酶的基因克隆、表达及酶学性质研究

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阿魏酸酯酶(FAEs,EC 3.1.1.73)属于羧酸酯水解酶的一个亚纲,其能够水解植物细胞壁中阿魏酸与多糖之间的酯键,从而将阿魏酸释放出来。阿魏酸酯酶在食品、饲料、医药、造纸、化妆品、生物能源、生物合成等领域均有广泛的应用前景。目前,来源于细菌的阿魏酸酯酶数目较少。本论文首次对芽孢杆菌阿魏酸酯酶进行了异源表达和酶学性质的研究。主要研究结果如下:1)将实验室保藏的122株芽孢杆菌置于含有阿魏酸乙酯作为碳源的筛选培养基中进行筛选,通过比较菌株产生的透明圈大小得到了一株阿魏酸酯酶活性较强的菌株:解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens H47)。2)根据对B amyloliquefaciens H47的全基因组序列分析预测了10个可能的阿魏酸酯酶基因,它们分别为Ba Fae01(906 bp)、Ba Fae02(780 bp)、Ba Fae03(774 bp)、Ba Fae08(696 bp)、Ba Fae09(741 bp)和Ba Fae10(822 bp)。对这10个基因进行了克隆表达,酶活验证发现只有Ba Fae04、Ba Fae06和Ba Fae09具有阿魏酸酯酶的活性,它们的蛋白分子量分别约为30 k Da、29 k Da和31 k Da。与其他细菌阿魏酸酯酶相比,这3个新型的阿魏酸酯酶展现了很低的序列相似度(均小于30%)。3)对这3个阿魏酸酯酶进行了酶学性质的研究。Ba Fae04、Ba Fae06和Ba Fae09的最适反应p H均为8,最适反应温度分别为30℃、35℃和40℃。Ba Fae04在25-60℃条件下保温1 h展现了较好的稳定性,在60℃下仍能保持59%的活性。52种酯底物水解实验结果显示3个阿魏酸酯酶都拥有广泛的底物水解范围,并且它们能够高效地水解阿魏酸酯酶常见底物。另外,这3个阿魏酸酯酶可以水解去淀粉麦麸的细胞壁并将其中的阿魏酸释放出来。3个酶对阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、对香豆酸甲酯和绿原酸的动力学参数如下:对于Ba Fae04,Km值分别为1.14、2.15、0.78和6.08 mmol·L-1,kcat/Km值分别为10.57、11.72、11.40和45.31 L?mmol-1·s-1;对于Ba Fae06,Km值分别为1.99、0.58、1.42和1.51 mmol·L-1,kcat/Km值分别为4.32、5.48、30.90和4.32 L·mmol-1·s-1;对于Ba Fae09,Km值分别为0.49、0.86、1.81和4.79 mmol·L-1,kcat/Km值分别为0.69、1.23、1.21和2.52 L·mmol-1·s-1
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