番鸭是非常优秀的肉鸭育种素材,生长快、瘦肉率比较高。但是,与一般肉鸭相比较,番鸭肉质粗糙。因此番鸭育种中亟待解决的问题是改善肌肉嫩度。钙蛋白酶1(CAPN1)可以降解肌原纤维进而影响肌肉嫩度。关于CAPN1基因的研究在猪、牛、羊、鸡等动物中已有报道,但是,国内外关于番鸭CAPN1基因的研究内容较少。为改善番鸭肌肉嫩度,促进番鸭新品种选育,本试验采用同源重组方法克隆了黑羽番鸭CAPN1基因编码区序列,然后进行生物信息学分析;利用qPCR技术,分析该基因m RNA在组织间、性别间以及各个发育阶段的差异表达规律;采用酶消化法成功分离了黑羽番鸭腿肌的成肌细胞;根据成纤维细胞和成肌细胞贴壁速度的不同的原理,对成肌细胞进行纯化;通过免疫荧光染色技术对成肌细胞进行鉴定;最后在成肌细胞中对CAPN1基因分别进行过表达和干扰,探究肌肉发育相关基因的表达变化规律。研究结果如下:(1)本试验克隆了黑羽番鸭CAPN1基因的CDS序列,确定全长为2148bp,编码氨基酸数量为715个,序列已提交至Gen Bank,登录号为:MT419750.1。同源性分析结果显示CAPN1基因保守性较高。系统进化分析结果与传统分类学结果一致。理化性质分析表明CAPN1蛋白相对分子质量为81 368.72 Da;理论等电点为5.82;亮氨酸使用频率最高,组氨酸使用频率最低;该蛋白属于稳定性、脂溶性和亲水性蛋白;有两个跨膜区,但是没有信号肽,主要分布区域是胞质;修饰结构分析表明可能的磷酸化位点有数量为59个,O-糖基化位点有9个和N-糖基化位点有3个。二级结构中α-螺旋含量最高,β-转角含量最低;保守结构域数量为3个。最后,建立了该蛋白的三级结构模型。(2)CAPN1基因在黑羽番鸭胸肌、腿肌、心、肝、肺、脾、肾、胃、小肠等9个组织中均有表达,没有明显的组织特异性;但母番鸭的表达量高于公番鸭。此外,从胚胎期15d到出壳后10w的不同发育阶段,胸肌和腿肌中有相似的表达规律;心和肝中有相似的表达规律;肺、脾、和小肠中有相似的表达规律;肾和胃中有相似的表达规律。(3)本试验成功分离并纯化了黑羽番鸭腿肌的成肌细胞;细胞分布均匀、生长良好,符合成肌细胞形态特征。运用免疫荧光染色技术对成肌细胞特有的标志性蛋白Desmin蛋白进行检测,确定所分离的细胞确是黑羽番鸭成肌细胞。(4)当CAPN1基因表达上调时,MyoD和MyoG基因表达也上调,Mrf5基因表达下调;当CAPN1基因表达下调时,MyoD和MyoG基因表达也下调,Mrf5基因表达上调;但是CAPN1基因表达的上调或下调对MSTN基因没有影响。本研究初步证实CAPN1基因参与肌肉发育调控,为进一步研究番鸭CAPN1基因的功能提供了前期研究基础。