第一部分携氧载ICG纳米粒制备及特性检测目的:制备携氧液态氟碳载吲哚菁绿PLGA纳米粒并进行其特性检测方法:采用双乳化-溶剂挥发法(w/o/w)制备携氧液态氟碳载吲哚菁绿PLGA纳米粒(OPI-NPs)、载携氧液态氟碳PLGA纳米粒(OP-NPs)和载吲哚菁绿PLGA纳米粒(I-NPs),光镜下观察形态、Malvern粒径测定仪测定OPI-NPs的粒径大小分布,UV-Vis分光光度计测定ICG的包封率及载药量,光声成像仪观察其光声显影能力,并与OP-NPs+free ICG及I-NPs的光声显影能力进行比较。结果:OPI-NPs为球形,平均粒径大小(275.24±7.28)nm,大小分布范围在80 nm—1000 nm之间,ICG的包封率约55%。OP-NPs+free ICG、I-NPs及OPI-NPs的光声显影强度分别为0.336±0.022,0.744±0.029及1.112±0.072。OPI-NPs及I-NPs的光声显影强度明显强于OP-NPs+free ICG,而OPI-NPs的光声显影强度明显强于I-NPs,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功制备OPI-NPs纳米粒,粒径相对比较均匀,且具有良好的光声显影能力。第二部分纳米粒激发的适宜激光、超声参数及纳米粒浓度的筛选目的:筛选出可以激发纳米粒相变及其破裂的适宜激光及超声参数及用于光声动力治疗的纳米粒ICG浓度。方法:1、激光参数筛选:将制备好的纳米粒稀释20倍,按照激光强度及辐照时间分组如下:0.5W/cm2,30s、0.5W/cm2,60s、1.0W/cm2,30s,1.0 W/cm2,60s、1.5 W/cm2,30s、1.5 W/cm2,60s、2.0 W/cm2,30s和2.0 W/cm2,60s。分别给予上述不同处理条件后,光镜下观察微球形态变化。2、超声参数筛选:将制备好的纳米粒稀释20倍,激光(2.0W/cm2,30s)辐照后,根据超声强度及辐照时间分组如下:0.44W/cm2,30s、0.44 W/cm2,60s、0.66 W/cm2,30s、0.66 W/cm2,60s、0.88 W/cm2,30s、0.88 W/cm2,60s、1.10 W/cm2,30s和1.10 W/cm2,60s。分别给予相应处理,处理后即刻光镜观察微球破碎情况。3、纳米粒ICG浓度筛选:取对数生长期的SKOV3细胞,根据纳米粒中ICG的浓度分组如下:对照组、0.5μg/ml组、1.0μg/ml组、2.0μg/ml组、4.0μg/ml组和8.0μg/ml组,共6组。分别将纳米粒与细胞共培养24h后,CCK-8检测细胞存活率。4、适宜激光、超声作用下对微球相变及击碎情况观察:,将制备好的纳米粒稀释20倍,分别取等量的纳米粒悬浮液放入凝胶孔中,分别在激光(2.0W/cm2,30s)辐照前后、激光(2.0W/cm2,30s)加超声(0.88W/cm2)辐照30秒及60秒后,诊断超声观察凝胶管回声变化、光镜观察微球形态变化、粒径测定仪测定微球粒径大小分布。5、适宜激光、超声作用下对细胞增殖的影响:取对数生长期的SKOV3细胞,分组如下:对照组、激光组、超声组及激光联合超声组。分别给予相应处理。应用CCK-8检测细胞存活率,观察各组对细胞增殖抑制情况。结果:1、当激光辐照能量达到1.5W/cm2时纳米粒发生明显相变,伴随着辐照时间的延长相变数目进一步增加,当激光能量达到2.0W/cm2时纳米粒相变数目明显增多,但随着时间的延长,相变数目无明显变化。2、当超声辐照能量为0.44W/cm2和0.66W/cm2时相变的纳米粒未见明显变化,伴随着辐照时间的延长仍未见明显的变化;当超声辐照能量达到0.88W/cm2时相变的纳米粒数目明显减少,伴随着辐照能量增加到1.10W/cm2时相变的纳米粒数目减少不明显,但随着辐照时间的延长至60s时,相变的纳米粒数目明显减少。3、被包裹的ICG浓度0.5μg/ml至4μg/ml之间对细胞无明显抑制作用,被包裹的ICG浓度达8μg/ml时细胞增殖明显受到抑制。4、激光激发前后的超声显影明显增强,光镜下观察纳米粒粒径增大,纳米粒平均粒径分别为275.24nm和1533.65nm;激光辐照后再进行超声辐照30s和60s较激光激发后的超声显影明显减弱,纳米粒平均粒径分别为1060.56nm和771.38 nm。5、激光(2.0W/cm2,30s)及超声(0.88W/cm2,60s)对细胞无明显抑制作用。结论:激光(2.0W/cm2,30s)可有效激发纳米粒发生相变,超声(0.88W/cm2,60s)可有效使相变的纳米粒破碎,且此能量下的超声及激光无论单独或联合作用,对SKOV3细胞生长均无影响。纳米粒ICG浓度≤4μg/ml对SKOV3细胞生长无抑制作用,故选择激光(2.0W/cm2,30s)、超声(0.88W/cm2,60s)及纳米粒ICG浓度4μg/ml作为本实验适宜参数用于后续研究中。第三部分携氧载ICG纳米粒协同光声动力对卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制及其机制的实验研究目的:观察光动力和声动力联合携氧纳米粒对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制及其机制。方法:1、不同处理方式对细胞生长抑制情况检测:将对数生长期的SKOV3细胞随机分6组:ICG+L+U组、I-NPs+L+U组、PI-NPs+L+U组、OPI-NPs+L+U组、OPI-NPs+L组和OPI-NPs+U组。分别进行相应处理,24小时后应用CCK-8检测各组细胞存活率;2、不同的纳米粒ICG浓度对细胞生长抑制情况检测:将不同ICG浓度(0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml和4.0μg/ml)的纳米粒加入到对数生长期的SKOV3细胞共培养24小时后,分别用激光(2.0W/cm2,30s)及超声(0.88W/cm2,60s)处理,处理后24小时,用CCK-8检测细胞存活率;3、不同方式处理后无细胞体系溶液内活性氧检测:按照ICG终浓度为4μg/ml的各样本加入96孔培养板中,然后各孔中加入浓度为50m M SOSG 0.02ml,按照不同处理方式分组如下:对照组、PBS+L+U组、ICG+L+U组、I-NPs+L+U组、PI-NPs+L+U组、OPI-NPs+L+U组、OPI-NPs+L组和OPI-NPs+U组;处理后20分钟,用酶标仪测各组溶液的荧光强度;4、纳米粒ICG浓度对无细胞体系溶液内活性氧产生情况的影响:将不同ICG浓度(0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml和4.0μg/ml)的纳米粒分别加入到96孔板钟,然后再加入浓度为50m M SOSG 0.02ml,用激光(2.0W/cm2,30s)联合超声(0.88W/cm2,60s)处理,处理后20分钟,用酶标仪测溶液的荧光强度;5、不同方式处理后细胞内活性氧检测:将对数生长期的SKOV3细胞分8组:对照组、PBS+L+U组、ICG+L+U组、I-NPs+L+U组、PI-NPs+L+U组、OPI-NPs+L+U组、OPI-NPs+L组和OPI-NPs+U组,分别加入ICG或纳米粒使溶液中的ICG浓度为4μg/ml,与SKOV3细胞共培养24h后,分别加入2μl DCFH-DA(10m M)共培养20分钟,然后用PBS冲洗3次,加入无血清培养液2ml,再予以激光和/或超声进行处理,处理后20分钟分别用流式仪检测活性氧荧光强度及荧光显微镜下观察细胞内活性氧指示剂显影情况。结果:1、PI-NPs+L+U组,OPI-NPs+L+U组和OPI-NPs+L组对细胞的增殖抑制率分别为(30.2±1.291)%,(77.24±0.4634)%和(59.06±2.003)%,明显高于其他各处理组(P<0.05);OPI-NPs+L+U组和OPI-NPs+L组对细胞的增殖抑制率明显高于PI-NPs+L+U组,OPI-NPs+L+U组对细胞的增殖抑制率明显高于OPI-NPs+L组,差异均有统计学意义(P<0.05)。2、伴随着纳米粒ICG浓度的增大细胞增殖抑制率也随着增加,4μg/ml组达到(72.04±5.273)%,明显高于其他各浓度组,差异均有统计学意义(P<0.05)。3、PI-NPs+L+U组,OPI-NPs+L+U组和OPI-NPs+L组无细胞体系溶液中的活性氧指示剂的荧光强度分别为185.3±19.46、440.1±11.47和355.6±31.15明显高于其他各处理组(P<0.05);OPI-NPs+L+U组和OPI-NPs+L组的活性氧含量明显高于PI-NPs+L+U组,OPI-NPs+L+U组的活性氧含量明显高于OPI-NPs+L组,差异均有统计学意义(P<0.05)。4、伴随着纳米粒浓度增加,细胞外活性氧的产生进一步增加,4μg/ml组达到440.1±11.47,明显高于其他各浓度组,差异均有统计学意义(P<0.05)。5、荧光显微镜见PI-NPs+L+U组,OPI-NPs+L+U组和OPI-NPs+L组细胞内均出现明显绿色荧光,,OPI-NPs+L+U组和OPI-NPs+L组的荧光较PI-NPs+L+U组明显;流式仪定量检测细胞内活性氧指示剂荧光强度可见:PI-NPs+L+U组,OPI-NPs+L+U组和OPI-NPs+L组细胞内活性氧指示剂的荧光强度分别为1935±53.14,2939±300.2和2935±295.3,明显高于其他各处理组,OPI-NPs+L+U组和OPI-NPs+L组细胞内活性氧的荧光强度明显高于PI-NPs+L+U组,差异均有统计学意义(P<0.05),而OPI-NPs+L+U组细胞内活性氧的荧光强度与OPI-NPs+L组无明显差异(P>0.05)。结论:激光联合超声激发携氧纳米粒能够明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,其机制可能与细胞内外活性氧的产生有关。