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背景:1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)是以T细胞破坏产生胰岛素的胰岛β细胞为特征的一种自身免疫性疾病,其发病受遗传和环境因素共同影响。在过去的几十年中,全球范围内T1DM的发病率显著增加,环境因素被认为在其中发挥关键作用,但目前机制尚不明确。最近,越来越多的研究表明肠道菌群与T1DM密切相关。天然免疫通过模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别菌体成分,从而保护宿主免受细菌侵袭。这些PRR包括Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)和核苷酸结合寡聚结构域样受体(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)。TLRs已被证实通过与肠道菌群之间的相互作用调节T1DM的发生发展。但是,对于人类和小鼠中NLR家族成员在T1DM中的作用却了解甚少。核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2,Nod2)能够识别细菌衍生的胞壁酰二肽,可诱导抗菌肽释放和维持肠道菌群稳态所需的炎症信号,其突变与克罗恩氏病(肠道常见的炎症性疾病)的高度易感密切相关。此外,小鼠Nod2缺乏与细菌易感性增加相关。然而,其在自发性T1DM中的作用尚不清楚。目的:探究模式识别受体Nod2在自身免疫性疾病——T1DM中的作用。方法:1.实验对象:培育了Nod2敲除的(Nod2-/-)NOD小鼠,并应用野生型(NOD2+/+)NOD小鼠作为对照。2.短期及长期同笼饲养:将3-4周龄的雌性Nod2-/-NOD或NOD2+/+NOD小鼠饲养在不同的笼子中,或将两种基因型的小鼠饲养在同一个笼子中。短期同笼饲养小鼠在9-10周龄时终止实验;长期同笼饲养小鼠在30周龄时终止实验。3.胰腺组织病理及胰岛炎评分:将胰腺用10%的福尔马林固定后进行石蜡包埋,制成切片进行苏木精-伊红染色,在光学显微镜下对胰岛进行计数及胰岛炎评分。4.粪便的细菌检测:收集单独或者同笼饲养的Nod2-/-NOD和Nod2+/+NOD小鼠新鲜粪便,提取细菌DNA。利用16S r RNA和q PCR技术对细菌组成进行检测。5.免疫细胞及细胞因子的检测:将淋巴器官和淋巴结制备成单细胞悬液,给予/不给予刺激物处理后,进行荧光抗体孵育染色,并于流式细胞仪进行检测。分泌型细胞因子利用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测。6.肠道细菌与脾淋巴细胞共培养:从2月龄雌性Nod2-/-NOD和Nod2+/+NOD小鼠的大肠内容物中提取细菌,洗涤后重悬于PBS溶液中。用分光光度计测定细菌浓度,并在90℃下加热灭活20分钟。将108个热灭活细菌分别与Nod2-/-NOD和Nod2+/+NOD小鼠的脾细胞(2×106/ml)共培养14小时。7.调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)免疫抑制功能测定:使用磁珠分离试剂盒分离脾和胰腺淋巴结中的Treg细胞(CD4+CD25+),并用丝裂霉素处理。分离NOD小鼠脾抗原递呈细胞(Antigen-presenting cell,APC),用丝裂霉素处理用作同种异体抗原刺激剂。分离C57BL/6小鼠的脾T细胞用作应答细胞。通过Treg对混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR)增殖的抑制作用来评估其免疫抑制功能。8.无菌小鼠的细菌定植:分别收集4-5周龄Nod2-/-NOD和Nod2+/+NOD小鼠的新鲜粪便制备成菌液。然后通过灌胃针,将菌液(2×108 CFU)灌胃给无菌的WT NOD小鼠。通过对定植小鼠粪便的16S r RNA细菌测序评估定植是否成功。9.统计分析:使用Graph Pad Prism 7软件进行统计分析。Log-rank检验用于比较糖尿病的发生率,Student’s t检验或方差分析用于分析体外实验结果。P<0.05被认为具有显著性差异。结果:本研究发现:1.糖尿病的发病与Nod2-/-NOD小鼠的肠道菌群高度相关。仅当将Nod2-/-NOD小鼠与Nod2+/+NOD小鼠(野生型小鼠)分开置于单独的笼子中饲养时,才表现出显著的T1DM保护作用。2.在NOD小鼠中Nod2敲除并没有影响树突状细胞和巨噬细胞的表型以及抗原递呈能力。但是Nod2及居住条件却显著影响了分泌Ig A的B淋巴细胞以及具有免疫调节功能的Treg细胞的数量和功能。3.体外实验证实,与Nod2+/+NOD同笼饲养的Nod2-/-NOD小鼠的肠道细菌影响了CD8+和CD4+T细胞促炎细胞因子的产生。4.用来自单独饲养的Nod2-/-NOD小鼠的肠道菌群定植无菌NOD小鼠,其免疫细胞的促炎细胞因子分泌显著减少,且Treg细胞数量显著增加。结论:1.Nod2对T1DM易感性的影响取决于肠道菌群的变化。2.Nod2主要影响Treg以及分泌Ig A的B细胞数量及功能。而不影响树突状细胞和巨噬细胞的表型以及抗原递呈能力。3.单独饲养的Nod2-/-NOD小鼠肠道菌群定植无菌小鼠,可以诱导更多的Treg细胞,进一步支持单独饲养下Nod2对T1DM的影响由肠道菌群对免疫系统的调节所介导。为肠道菌群可调节免疫系统和T1DM易感性提供了进一步的证据。4.研究结果提示,在T1DM研究中解释基因编辑小鼠疾病表型时应注意同笼效应带来的影响。