目的探寻纤维蛋白原Bβ (FGB)启动子区可能存在的单核苷酸多态性(SNPs)位点(已知或未知的)并由此构筑Logistic回归模型和单倍型模型,从而在遗传背景上揭示FGB启动子区SNPs对特发型下肢深静脉血栓形成(IDVT)易感性、血流动力学和凝血功能(包括血浆纤维蛋白原水平等)的影响。方法本课题分为两个部分：第一部分,特发型下肢深静脉血栓形成临床相关因素研究。为了尽量排除混杂因素的干扰,并着重考察遗传因素对DVT发病的影响,病例组入选标准为我院门诊和住院部经彩色多普勒确诊的特发型下肢深静脉血栓患者(Idiopathic deep venous thrombosis, IDVT)。所有患者均为首次发病且未经过任何治疗(包括手术、抗凝和溶栓等)。病例组和对照组各随机选择120名,来自于云南省各县市,均为汉族。两组年龄及性别无明显统计学差异；无甲状腺和肝、肾功能衰退及代谢性疾患等。使用彩色多普勒收集上述人群的血流动力学参数(包括IDVT解剖分型、肢体受累范围和股、膪静脉流速峰值、内径等)；采集上述人群的血细胞分析、血生化指标和凝血功能指标(主要有红细胞沉降率、凝血酶原时间、纤维蛋白原、凝血酶时间和活化部分凝血活酶时间等)。同时,收集受试者的残余血标本,置于1.5ml EP管,置于-80℃冰箱中冻存备用。第二部分,纤维蛋白原B β启动子区基因多态性与特发型下肢深静脉血栓形成的相关性研究。采用长段基因测序的方法探寻FGB基因整个启动子区(1560bp)所有可能存在的SNPs并分析它们与IDVT易感性、血流动力学和凝血功能(包括红细胞沉降率、凝血酶原时间、纤维蛋白原、凝血酶时间和活化部分凝血活酶时间等)的关系。同时,为了更好的理解聚合酶链反应·限制性长度多态性(PCR·RFLP)这一传统方法对SNPs研究的贡献；也为了制造DVT相关基因芯片找到便捷、可行的RFLP瑚南在对所有样本成功测序后随机选取40例样本的PCR产物进行PCR·RFLP检测(每组各随机选取20例)。检测结果与测序结果完全相符。主要方法有：1、各SNPs位点Hardy-Weinberg遗传平衡度检验；2、各SNPs位点连锁不平衡分析(Linkage Disequilibrium tests, LD);3、分析IDVT组和对照组各SNPs的基因型频率和等位基因频率差异；4、IDVT多因素Logistic回归分析；5、构筑FGB启动子区SNPs单倍型模型；6、分析FGB启动子区SNPs对IDVT血流动力学的影响；7、分析FGB启动子区SNPs对凝血功能的影响(包括血浆纤维蛋白原水平等)。结果实验结果显示：第一部分1、IDVT组和对照组性别、年龄构成比(包括总体比较和各年龄阶段分层比较)均无明显统计学意义(均P>0.05)。2、分析血流动力学参数后发现：(1)本组IDVT患者在收治住院时以亚急性期和慢性期最为多见,所占比例达55%,也因此丧失了最佳治疗时机；(2)解剖分型则以周围型最多见(51.7%),其次是混合型(35%),中央型比例最小(13.3%)；肢体累积范围以左下肢为主(63.3%),其次是右下肢(27.5%)和双下肢(9.2%)；(3) IDVT组股、胭静脉流速较慢,低于对照组(均氏0.05)；IDVT组股、胭静脉内径增宽,高于对照组(均P<0.05)。3、分析凝血功能指标后发现：IDVT组红细胞沉降率(ESR)、纤维蛋白原(Fg)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)高于对照组：而凝血酶时间(TT)低于对照组;4、IDVT组-对照组大部分血常规、血生化指标无统计学差异(均P>0.05)；白细胞计数、血小板计数、白蛋白含量、谷草转氨酶、肌酐含量在2组间虽有统计学差异(均P<0.05),但都在正常生理范围,且这种差异多与DVT疾病本身有关。第二部分1、经长段基因测序后证实：(1)在FGB启动子区存在6种SNPs,即β-148C/T(rs1800787), β-249C/T (rs1800788), β-455G/A(rs1800790), β-854G/A(rs1800791), β-993C/T (rs2227389), β-1420G/A(rs1800789):(2)在240例样本中均没有发现β-854AA纯合子基因型；(3)在对照组中-887位点即发现一例疑似CC突变的基因型(-887AA→CC,正常为从野生纯合子基因型)。2、除了对照组中1个SNP(β-249C/T,χ2=8.661103)外,对照组其余5个SNPs和实验组所有SNPs均达到Hardy-Weinberg遗传平衡。3、β-993C/T与β-455G/A(r2=0.699)、β-993C/T与β-148C/T(r2=0.509). β-455G/A与β-148C/T(r2=0.556)之间观察到较强的两两连锁不平衡关系。4、β-1420G/A、β-455G/A, β-249C/T, β-148C/T的基因型频率和等位基因频率在下肢IDVT组和对照组之间存在显著统计学差异(均P<0.05)；β-993C/T和8-854G/A的基因型频率和等位基因频率在IDVT组和对照组之间无统计学差异(P>0.05)。5、通过多因素Logistic回归分析,我们发现：(1)纤维蛋白原(Fg)含量越高的人,患下肢IDVT的危险性就越高。纤维蛋白原每增加1个单位,IDVT的发病风险相应增加4.579倍;(2)β-1420A、β-148T等位基因是IDVT的危险因素且具有统计学意义(P<0.05),上述等位基因携带者IDVT的发病风险分别为非携带者的3.445、5.375倍;(3)β-455A等位基因是IDVT的保护因素,其发病率是非携带者的的0.088倍,即β-455A等位基因的存在可使IDVT的发病风险降低91.2%。6、在两组人群中共发现26种单倍型(病例组中21种,对照组中18种)。考虑到单倍型构筑的实际意义,我们在EH程序中将病例-对照组中频率都小于3%的单倍型予以排外,得到8种单倍型。H1.H3.H4.H5.H6和H7共6种单倍型分布频率在病例组和对照组之间存在显著统计学差异(P<0.05)： H3、H6单倍型在IDVT组出现频率较高(0R分别为32.085和1.896),属于IDVT易感单倍型；H1、H4、H5和H7单倍型在对照组出现频率较高(0R分别为0.025、0.119、0.644和0.383),属于保护单倍型；其余单倍型(H2和H8)在两组之间无显著统计学差异(P>0.05),属于无义单倍型。7、上述6个SNPs与IDVT的解剖类型、肢体累积范围以及血流动力学(包括股、胭静脉内径和流速)之间均未发现统计学关联。8、FGB启动子区SNPs与凝血功能的关系：(1)在正常对照组,只有ESR、Fg在β-993C/T两种基因型之间存在统计学差异(均P<0.05);(2)在IDVT组,所有凝血指标在所有SNPs相应基因型之间均无统计学差异(均P>0.05)。结论1、本组受试人群种族、地域以及发病因素选择针对性强,无论在年龄、性别甚至遗传学(Hardy-Weinberg遗传平衡)方面均具有良好的均衡性,适合作基因和遗传学研究。2、在IDVT的整个自然病程中,随着血栓反复发作,血液高凝和低凝状态可能会交替出现,呈现动态平衡,有时甚至难以界定。3、SNPs研究方面,将受试人群临床特征(除了IDVT易感性外,还包括解剖类型、凝血功能和血流动力学等参数)与后续基因类型研究结果相结合加以联合考察。从这个意义上讲,该项目的针对性和研究深度都将超越以往为数不多的同类型研究。4、基因测序技术完全可以满足SNPs研究的绝大部分需求。对于大规模、长序列,特别是多个目标均在同一DNA区域的SNPs研究,基因测序技术比限制性长度多态性方法(PCR-RFLP)更为准确、直观、快捷,利于“由点到线”进行研究以及发现未知SNPs和基因突变位点(本实验在-887位点即发现一例疑似CC突变的基因型)。5、纤维蛋白原(Fg)每增加1个单位,IDVT的发病风险相应增加4.579倍。因此,Fg很可能是IDVT的独立危险因素；6、无论是单因素或多因素Logistic回归分析,都提示：(1)β-1420G/A、β-455G/A,β-148C/T可能直接影响IDVT的易感性—β-1420A、β-455G、β-148T等位基因是IDVT的危险因素,而β-1420G、β-455A、β-148C等位基因是IDVT的保护因素；(2)β-993C/T可能通过提高血浆Fg基础水平及与β-455G/A、β-148C/T的连锁不平衡方式对IDVT易感性产生间接影响；(3) β-854G/A多态性可能与云南地区汉族人群IDVT易感性无关；(4)因对照组β-249C/T未达到Hardy-Weinberg遗传平衡,其对IDVT易感性的影响值得商榷。7、H3、H6属于IDVT易感单倍型；H1、H4、H5和H7属于保护单倍型； H2和H8属于无义单倍型；8、在上述6个SNPs与IDVT解剖类型、肢体累积范围以及血流动力学(包括股、胭静脉内径和流速)之间均没有发现统计学关联,但不能据此否定FGB启动子区SNPs对IDVT血流动力学产生的影响；9、在IDVT状态下,所有凝血指标在6个SNPs相应基因型之间均无统计学差异,但不能据此否定FGB启动子区SNPs对IDVT凝血功能、特别是Fg的影响。