背景：皮肤是人体最大的器官,而毛囊又是皮肤的重要附属器,其呈周期性、有规律地自我再生,在人体内终生不断,是调控毛发周期生长的重要结构。健康成人头发总数平均有5-15万根,其生长受年龄、气候、环境及健康状况等多种因素影响,而秃发的诱因包括各种疾病、药物、医源性等因素。目前,毛发的再生研究不但将给需要毛发移植的患者带来福音,更将对组织工程和器官再生领域产生极大的影响。另外,它对研究上皮与中胚层起源细胞之间的相互作用,器官和组织再生、色素形成、伤口愈合及皮肤癌的发病机制等重要生命过程来说都是极好的模型。对于哺乳动物来说,毛囊是一个特殊的器官,它由真皮和表皮成分组成。一个毛囊包括同心圆结构的上皮鞘,即毛干、内根鞘、外根鞘,被和毛囊底部真皮乳头相连的真皮鞘围绕。在外根鞘中间膨大部位称为隆突部,这里有表皮干细胞的聚集。这些干细胞同毛囊底部的真皮乳头相互作用,最终发育为不同类型的毛囊细胞。在胚胎发生期间,形成真皮乳头基板的真皮浓集同表皮胚芽相互作用诱导出完整的毛囊。真皮乳头被认为是毛囊发育和循环生长所必须的。不仅仅是真皮乳头细胞,培养的真皮聚集细胞植入鼠的皮肤也能诱导新的毛囊形成,而且将维持供体毛囊的表现型。因此,真皮乳头细胞(Dermal papilla cells, DPCs)的移植对于人类来说期待其作为一种细胞疗法应用于临床。毛发在一生中经历再生循环。两种主要的成分,毛囊上皮和真皮乳头通过相互的交流从而发育并形成毛囊。DPCs对于毛囊的诱导是必不可少的。那么在研究DPCs诱导能力的表面标记的过程中我们知道,CD133、CD34、CD44及多能聚糖(Versican)同毛囊诱导能力有关。CD34、CD133均是人体造血干细胞的表面标记物,其中CD34代表了细胞的干细胞特性,而CD133的阳性表达不仅说明细胞具有干细胞特性,而且同毛囊细胞的毛囊诱导能力有密切关联。CD44是种细胞粘附分子,代表细胞具有粘附特性。研究表明,CD34、CD133、CD44都是正常组织幼稚细胞的标志物。多能聚糖是DPCs所产生的主要细胞外介质,同细胞的聚集性生长有关。据报道,表达多能聚糖的DPCs具有毛发诱导能力。DPCs能够通过取鼠的触须和人的头皮毛囊来收集。由于毛乳头结构小,因此很难将其从成体皮肤的毛囊中分离出来。目前国内外主要采用显微解剖法和酶消化法来获取DPCs,虽然方法在不断改进,但关键的分离步骤仍然要依靠显微解剖,操作过程不仅需要技巧和耐心,而且工作强度大,获取效率低,同时增加了污染机会。因此在毛囊再生的研究中,迫切需要一种简易的实验操作来获得大量的具有毛囊诱导能力的细胞,为毛囊组织工程重建及临床细胞疗法治疗脱发打下实验基础。目的：1.寻找一种简易的实验方法以及适当的组织来源获取毛囊细胞。2.证实所获取的毛囊细胞具有干细胞特性和毛囊诱导能力。3.毛囊混合细胞进行体内移植试验,尝试诱导出新生毛囊及毛发纤维。方法：1.C57鼠真皮细胞的分离、培养。取生后第一天的C57鼠背部皮肤,剪为约0.5cm×0.5cm大小组织块,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜。PBS漂洗3次,显微镊将表皮和真皮分离。真皮剪碎,0.2%胶原酶37℃孵育30min左右,直到所有组织被消化。加入DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清)终止消化。200目筛网过滤,去除组织碎片和细胞团块,收集单细胞混悬液于离心管离心(1000r/min)5min,重复离心2次,弃上清液,加入DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清)。取1.5ml细胞混悬液接种至25ml培养瓶,加入2ml培养基,置于孵箱中,24h换液。2.C57鼠真皮细胞毛囊诱导能力的鉴定。2.1细胞活性检测：将获得的细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按1：1体积比混合后,滴入细胞计数板置于显微镜下观察。细胞采用3份标本,每份标本随机于40倍显微镜下取3个视野,镜下观察不着色、发亮的为活细胞,着色、胞体膨胀大者为死细胞。分别计数未染色细胞数及细胞总数,计算未染色细胞占细胞总数的百分比。2.2免疫组织化学检测：将细胞接种于干净盖玻片上,PBS漂洗2次(5min/次),4%甲醛固定30min后PBS漂洗3次(5min/次)。0.1%Triton X-100/0.1%柠檬酸三钠溶液破膜,室温10min,PBS洗3次(5min/次)。封闭内源性过氧化物酶：3%H202室温孵育10min,PBS洗3次(5min/次)。正常山羊血清室温封闭10min。一抗(一抗浓度：CD133 1：150；Versican 1：100)孵育：将细胞爬片于DAKO抗体稀释液稀释的抗体溶液中4℃孵育过夜。复温15min。PBS洗3次(5min/次),DAKO anti-mouse/rabbit二抗室温孵育40min。PBS洗3次(5min/次)。DAB显色,室温1-10min,显微镜下掌控。ddH2O洗3次,5min次。苏木素复染后,PBS返蓝。脱水,透明,中性树胶封片。结果以奥特BK5000生物显微镜、尼康D60拍照。2.3流式细胞检测分析：将台盼蓝染色>95%活力的细胞以106/孔种于12孔板,0.25%胰蛋白酶收集细胞。重悬于含有1：50稀释的FITC-CD34和FITC-CD44抗体或1：20稀释的FITC-CD133抗体(以1：50稀释的mouse IgG/FITC作为对照),37℃,30min。流式细胞仪激发波长Ex=488nm；发射波长Em=530nm。检测阳性率。3.毛囊细胞移植。将获取的真皮细胞、表皮细胞以2：1的比例混合制成混合细胞悬液。选取4-6周龄裸鼠,雌雄不限,0.8%戊巴比妥钠行裸鼠腹腔内注射麻醉,常规消毒裸鼠背部皮肤,无菌条件下1ml注射器将毛囊混合细胞悬液、单纯表皮细胞悬液、PBS分别注射到裸鼠背部皮下。注射后定期(2、4、8周)大体观察毛囊形成、发育、重建和毛干生长情况。移植部位4%多聚甲醛固定,常规石蜡切片,HE染色,镜下观察。结果：1.新生鼠皮肤经中性蛋白酶消化后分离下来的真皮部分成絮状,色微红；表皮易漂浮,成片状,色银白。体视镜下观察真皮似海绵,其中可见大量微细血管；表皮银白色,铺路石状。2.通过中性蛋白酶和胶原酶消化获得的新生鼠真皮细胞,细胞活力>95%。接种24h内约80%可以贴壁,初为小圆形,细胞大小不均匀,核、浆比较大,24h后逐渐伸展为短梭形及多角形和长梭形,4d后形态呈成纤维细胞样,核椭圆形,较大。原代培养的细胞7d即达70%-80%融合。并随着传代次数的增加,细胞体积逐渐增大。3.消化下来的真皮细胞呈凝集性生长,细胞培养三天后所形成的凝集物结构外形上观察,表面光滑且成球形。在光镜下可观察到凝集物中细胞均匀混合在一起且无明显基底物质。4.细胞免疫组织化学染色检测鼠原代真皮细胞CD133、多能聚糖的表达情况,见胞浆、胞膜着色,呈阳性。5.流式细胞检测结果显示阳性细胞百分比分别为：CD34(62.5%)；CD44(41.97%);CD133(52.1%);IgG(71.9%)。6.大体观察混合细胞移植部位2周后呈现轻微的隆起,可见色素沉着,翻开移植部位皮片,体视显微镜下可见皮下有毛发纤维生成并于4周后可观察到毛干长出,之后肉眼可逐渐观察到穿出皮肤的黑色毛干。注射部位中,大部分毛发纤维成形于皮下却没有穿出皮肤,个别长出的毛干脱落后2周内又有新的毛干长出。7.组织取材切片后镜下观察：混合细胞注射移植2周后,取移植部位组织切片染色。光镜下可见大量呈同心圆排列的毛囊结构,其中心为嗜伊红染色的角化物质,向外依次为：内根鞘、外根鞘、真皮鞘。而对照组在组织学上无改变。结论：1.以C57新生鼠背部皮肤作为组织来源,联用中性蛋白酶和胶原酶消化分离得到真皮细胞。实验操作简便易行,减少污染机会,单次操作分离细胞数量大。且C57鼠毛发呈黑色,体内移植易于观察。2.所得细胞为成纤维细胞样,易贴壁,经检测具有干细胞特性及较强的毛囊诱导能力,体外培养呈凝集性生长。3.将混合细胞裸鼠皮下移植能够再生出新的毛囊并可观察到毛发纤维的形成。