论文部分内容阅读
目的：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是老龄人群中最常见的中枢神经系统退行性疾病，严重损害患者的认知功能。随着社会人口老龄化的不断加剧，AD的防治已经成为一个严峻的社会问题。目前，对于AD尚没有理想的治疗方法，寻求有效的治疗药物成为研究者的努力方向之一。大量研究表明，β-淀粉样蛋白（Amyloid-β, Aβ）在脑实质内的聚集和沉积是导致患者脑内神经元变性、丢失乃至形成痴呆的关键因素。因此，很多研究致力于开发干扰Aβ合成和沉积的药物类型。目前，通过提高自噬（Autophagy）活性促进Aβ清除的方法逐渐成为研究热点。自噬是溶酶体对受损细胞器和老化、毒性蛋白进行吞噬降解的一种主动清除方式，对维持细胞内环境稳定和行使正常生理功能起着积极的作用。有研究发现，在AD患者及动物模型中，存在自噬水平的降低，可能与AD的发病有关。适度提高自噬溶酶体途径（autophagic–lysosomal system，ALP）的活性，可以加速有聚集倾向的蛋白的降解，有可能对Aβ等蛋白沉积引起的神经退行性疾病如AD起到治疗作用。很多研究表明环孢素A(Cyclosporin A, CsA)具有神经保护作用，而且近期有文献报道CsA能够在大鼠脑细胞中诱导自噬，但是尚未见报道CsA对AD有无保护作用，对自噬水平有何影响。我们利用Aβ25-35干预PC12细胞24h建立AD的体外细胞模型，观察不同浓度CsA对受损PC12细胞的活力及代谢状态、存活率以及形态学的影响，并观察CsA对受损PC12细胞的保护作用是否与自噬通路相关。方法：（1）PC12细胞株使用含10%胎牛血清、5%马血清、100ng/L链霉素、0.1U/L青霉素的高糖DMEM培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。（2）分别给予0μM、10μM、20μM、30μM的Aβ25-35干预PC12细胞24h后，MTT法检测各组细胞活力，以判断不同浓度Aβ25-35对PC12细胞的损伤程度，并选取适合浓度（20μM）的Aβ25-35干预PC12细胞，建立AD的体外细胞模型。使用0.1μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM环孢素A（CsA）对PC12细胞预处理24h后，给予20μM的Aβ25-35继续培养24h。MTT法检测细胞活力及代谢状态，从中选取CsA的有效保护剂量(0.5μM)用于后续实验。将细胞分为正常对照组、模型组、0.5μM CsA预处理组，分别进行如下实验：①光镜下观察各组PC12细胞形态学变化。②Hoechst33258/碘化丙啶（propidiumiodide，PI）双染法检测各组细胞的存活率。③免疫荧光染色法检测细胞LC3的表达，观察自噬活性的变化。结果：（1）AD模型的建立：给予PC12细胞不同剂量Aβ25-35处理后进行MTT检测，结果显示Aβ25-35对PC12细胞具有损伤作用，且呈剂量依赖性。其中，20μM Aβ和30μM Aβ组与对照组相比，光密度值具有统计学差异（P=0.000; P=0.000），本实验选择20μM Aβ对PC12细胞处理作为AD的体外细胞模型。（2）CsA有效剂量的选择：给予各组PC12细胞相应处理后，使用酶标仪检测570nm处的光密度值。模型组细胞光密度值较空白组明显降低（P＜0.001），与前实验结果相符；0.5μM CsA预处理的PC12细胞光密度值与Aβ25-35处理组相比明显增高（P＜0.05）。而0.1μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM CsA预处理组对PC12细胞活力及代谢状态无明显改善作用（P＞0.05）。因此，选取0.5μM CsA预处理PC12细胞用于后续实验。（3）CsA对Aβ25-35损伤PC12细胞形态的影响：正常对照组的PC12细胞生长状态良好，胞体饱满、明亮，突起伸展充分，贴壁良好。模型组细胞状态明显变差，胞体变暗，突起短小，视野内可见大量脱落的细胞碎片。而0.5μM CsA预处理组的PC12细胞状态与单纯Aβ组相比有明显改善，贴壁良好，突起较长，细胞形态较完整，细胞碎片少见。（4）CsA对AD模型细胞存活率的影响：空白对照组细胞存活率最高，20μM Aβ25-35处理组细胞存活率较对照组明显降低，结果有统计学差异(P=0.007)；0.5μM CsA预处理的PC12细胞存活率较单纯Aβ组有明显改善，具有统计学差异(P=0.012)。（5）CsA对模型组细胞自噬活性的影响：对照组PC12细胞LC3荧光较强，范围涵盖胞核以外的整个胞体；模型组细胞LC3荧光强度较正常组细胞明显减弱，大部分细胞未见阳性染色，少数细胞LC3阳性区域仅出现于核周。0.5μMCsA预处理组细胞整体荧光强度高于Aβ处理组，且阳性区域更广，少见阴性细胞。结论:（1）20μMAβ25-35处理PC12细胞24h可造成明显的细胞损伤，细胞出现形态学改变，部分细胞死亡。（2）0.5μMCsA预处理24h可明显减轻Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤，改善细胞的活力及代谢状态，提高细胞存活率。（3）CsA对Aβ25-35诱导的PC12细胞的保护作用可能与其提高细胞的自噬活性有关。