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Dravet综合征又称婴儿重型肌阵挛性癫痫(severe myoclonic epilepsy in infancy,SME),是一种罕见的主要由遗传因素引起的恶性癫痫综合征,常伴有认知损害及自闭症倾向。具有发病年龄早、发作形式复杂、发作频率高、智力损害严重、药物治疗有效率低、预后差、死亡率高等特点,是热性惊厥叠加全面性癫痫附加征(GEFS+)中最严重的表型。分子遗传学研究证实Dravet综合征与电压依赖性钠通道a1-亚单位(voltage-gated sodium channel a1-subunit,SCN1A)基因突变密切相关。随着比较基因组杂交技术(microarray comparative genome hybridization,aCGH)的发展,科学家发现在Dravet综合征患者基因组中某些拷贝数变异(copy number variations,CNVs)与难治性癫痫密切联系,涉及SCN1A、EPHA5等易感基因。随着iPS技术的兴起,为建立Dravet综合征体外模型提供了新的研究思路,减少了伦理、法律及免疫排斥等问题。目前很多研究建立的特定诱导分化体系中所使用的诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)遗传背景不一样,因其细胞来源个体本身就存在显著基因组差异。因此,研究干细胞基因组稳定性至关重要。本研究选择新型强大的细胞遗传分析平台—aCGH,准确而快速地发掘和诊断CNVs;利用Dravet综合征患者的皮肤成纤维细胞重编程为iPSCs,分析这种疾病体细胞及相应iPSCs的基因组CNVs。本研究表明,患者家系中SCN1A相同位点基因突变者的症状不尽一致,这些可能与各自存在不同的CNVs密切有关。体细胞存在与癫痫相关的致病性CNVs;通过重编程,早代iPSCs基因组状态不稳定,增加许多CNVs,该区域涉及与细胞循环、凋亡、肿瘤等相关的基因。 第一部分Dravet综合征-iPS系的建立及其生物学特性鉴定 【研究目的】 了解患病家系SCN1A基因突变情况及症状,重编程Dravet综合征先证者成纤维细胞,获得iPS细胞并进行鉴定,为后续研究疾病的发生机制、诱导分化、药物筛选及表观遗传学研究等方面提供良好的模型。 【研究方法】 1.测序验证先证者家系SCN1A基因突变情况。 2.收集Dravet综合征先证者皮肤成纤维细胞并培养。利用逆转录病毒介导的四个转录因子重编程患者成纤维细胞,筛选出iPSCs,当克隆形态较大时机械挑取进行传代。 3.选取生长状态良好的iPS克隆进行多能性、体外分化、核型、STR及SCN1A基因突变的鉴定。 【结果】 1.先证者及其父亲、弟弟均为SCN1A突变c.4284+2T>C。父子三人症状不同。 2.先证者成纤维细胞的培养,可见组织块边缘有长梭形纤维细胞长出。先证者iPS细胞的诱导。感染后大约20天可获得iPS细胞克隆。iPS细胞碱性磷酸酶染色为强阳性,镜下见克隆中细胞密集区出现紫黑色颗粒,从AP染色结果发现iPS细胞形成效率约为0.20％。 3.iPSCs能维持自我更新状态,具有与ES细胞相似的形态、多能性和体外分化能力,重编程前后其核型、STR位点及SCN1A基因突变与患者体细胞一致。 【结论】 1.本患病家系中SCN1A相同位点突变但症状轻重不同,可能与SCN1A的表达调控及其它癫痫相关基因突变或用药状况有关。该家系适合建立体外模型进行机制研究。 2.成功建立一株Dravet综合征iPS细胞系,为研究疾病的发生机理、诱导分化、药物筛选及表观遗传学研究等方面提供良好的细胞模型。 第二部分Dravet综合征重编程前后基因组微失衡的相关研究 【研究目的】 1.分析Dravet综合征家系中各受检者基因组拷贝数的变异。 2.研究Dravet综合征家系中父子三人症状差异与基因组拷贝数变异的关系。 3.研究重编程过程是否影响基因组稳定性,进一步探讨iPS建系的有效性。 【研究方法】 1.利用高分辨率的Affymetrix CytoScan HD芯片检测Dravet综合征家系中不同患者,分析与癫痫症状相关的基因组拷贝数变异的关系。 2.利用高分辨率的Affymetrix CytoScan HD芯片检测Dravet综合征先证者的体细胞及早代iPS细胞,分析重编程后基因组CNVs及杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)的变化。 【结果】 1.Dravet综合征家系成员发现致病性CNVs,父子三人间CNVs不一致。该家系中,先证者父亲具有中国汉族人群原发性癫痫的易感基因CACNA1H,先证者及其弟弟具有与Mg2+相关的基因SMPD4。 2.Dravet综合征先证者体细胞与相应iPSCs的LOH未发现明显差异,iPSCs的CNVs明显增多,且均为微重复,涉及致癌基因。 【结论】 1.Dravet综合征家系成员存在致病性CNVs,父子三人间CNVs不一致,与其症状差异有关。 2.本研究证明重编程过程中基因组稳定性发生动态变化,长期培养需要经常监测iPS细胞保证其基因组稳定性及临床安全性。