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本课题利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,敲除大鼠RBL-2H3细胞CnAβ基因以构建基因敲除细胞突变株,并探讨CnAβ基因对体外RBL-2H3细胞活化脱颗粒的影响。设计三个单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),靶向CnAβ基因的外显子1。以pX459质粒为骨架构建表达sgRNA的打靶载体。用脂质体3000转染法将构建好的质粒导入大鼠RBL-2H3细胞中,实现基因敲除。在嘌呤霉素筛选后,利用PCR扩增并测序初步检测靶基因的敲除情况。PCR验证3种细胞(成功敲除的细胞KO,空载体细胞MOCK,野生细胞WT)的转录情况;甲苯胺蓝染色检测大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒后的形态变化;WST-1法测定细胞活力及毒性作用;IgE刺激后检测诱导剂(DNP-BSA,C48/80,LPS)的最佳诱导时间和剂量及细胞的脱颗粒情况。研究获得具体结果如下:1.利用CRISPR/Cas9技术,大鼠RBL-2H3细胞CnAβ基因被成功敲除,通过PCR扩增检测到完整敲除外显子1附近381 bp(exon1整个敲除)。2.PCR扩增3种细胞后,凝胶电泳显示敲除成功的细胞无特异性条带,表明敲除CnAβ基因后无法在转录水平检测。3.3种细胞在A23187诱导脱颗粒后经甲苯胺蓝试剂染色于40倍油镜下观察其状态。当细胞脱颗粒完成后,细胞被染成浅蓝色,细胞整体变大,细胞膜边缘不整齐,胞质中有明显的颗粒,同时存在空泡结构。4.在培养基与WST-1为10:1的比例下培养3种细胞5天后,测定其生长曲线显示细胞在第一天处于对数生长期,其后便处于平稳期,且3种细胞生长趋势无差异,即敲除CnAβ基因对细胞生长无影响。5.WST-1毒性实验结果显示细胞生长趋势无差异,即敲除CnAβ基因对细胞生长无毒性作用。6.C48/80的最佳诱导浓度是100μg/ml,DNP-BSA的最佳诱导浓度是10μg/ml,而LPS的最佳诱导浓度是1μg/ml,三者的最佳诱导时间都是1 h。相比之下,DNP和C48/80诱导脱颗粒能力相当,LPS则较弱,但在敲除CnAβ基因后都明显降低了细胞的脱颗粒情况。综上所述,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除了大鼠RBL-2H3细胞CnAβ基因建立了细胞突变株。肥大细胞经刺激脱颗粒后变大变圆,染色变浅且有空泡结构出现。3种诱导剂(C48/80、DNP、LPS)诱导细胞脱颗粒的最佳浓度分别是100μg/ml,10μg/ml,和1μg/ml,最佳诱导时间是1 h。敲除CnAβ基因后都明显降低细胞脱颗粒的情况,但对细胞生长无影响。