抑制线粒体通透性转换对心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用目的线粒体功能障碍在心肌细胞应激性损伤中占有重要地位，近年研究发现线粒体的功能障碍和线粒体通透性转换孔道（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）状态密切相关，mPTP开放导致的线粒体通透性转换（mitochondrialpermeability transition，MPT）被认为是调控细胞死亡或生存，以及凋亡或坏死的重要环节。mPTP是由位于线粒体膜上多蛋白组成的非选择性复合孔道，其主要由外膜的电压依赖性阴离子通道（VDAC），内膜的腺苷酸转位子（ANT），基质的亲环蛋白D（CyP-D）组成。最近研究认为外周苯二氮（艹卓）受体（peripheral benzodiazepinereceptor，PBR）、已糖激酶、肌酸激酶（CK）可能也参与mPTP的构成。MPT在细胞应激状态（如氧化应激、生长因子去除或暴露于细胞质分裂酶）时起到“中央执行者”的作用。MPT导致线粒体膜电位下降、氧化磷酸化解耦联、ATP损耗、小分子溶质和离子在细胞质和线粒体基质间的平衡。溶质内流入线粒体基质导致线粒体基质膨胀，外膜破裂，线粒体内膜蛋白释放，包括细胞色素C（Cyt c）、procaspase9、AIF（凋亡诱导因子）、核酸内切酶（Endo G）。MPT的调控对维持线粒体内膜的不通透性（除了对一些选择性的代谢物）起到重要作用，以维持线粒体膜电位，保证氧化磷酸化过程中ATP的合成。MPT在心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用，随着缺血时间延长，线粒体发生MPT的潜在可能性增加，称为MPT启动（priming）阶段，然而再灌注的条件可以调节MPT能否被触发，称为MPT触发（trigger）阶段。缺血缺氧期间细胞内Ca²⁺升高，pH值下降，长链脂肪酸（LCFA）增多，ROS产生，启动MPT。MPT触发阶段，受再灌注期间MPT诱导／抑制因素(尤其是基质Ca²⁺和ROS水平)的相互作用和再生膜电位的电子传递能力的影响，而后者对缺血期间的Cyt c失和内膜通透程度高度敏感。因为mPTP的开放是电压依赖性的，当mPTP暂时关闭时电子传递再生膜电位的速率决定了mPTP保持开放还是关闭。膜间隙Cyt c量和内膜通透性是控制电子传递再生膜电位速率的决定性因素，所以Cyt c失和内膜通透性增加通过抑制膜电位恢复速率，使暂时关闭的mPTP再开放的概率增加。而且Cyt c耗加重氧化应激，促进mPTP开放。由于MPT造成的线粒体不可逆的去极化最终通过破坏能量产生而导致细胞坏死，心脏要从缺血再灌注损伤中恢复，首先必须要恢复粒体功能。因此，本研究的目的是探讨抑制MPT对心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响。实验材料1、实验动物及主要试剂出生1-2d的新生Sprague-Dawley（SD）纯种大白鼠，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。环孢菌素A（CsA）购自Fluka BioChemika公司。鼠单克隆抗Cyt c抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记标记的的抗小鼠IgG购自Cell signaling公司。Calcein-AM购自美国Sigma公司，线粒体／胞浆蛋白分离试剂盒C1260购自Applygen公司，MHCα／β抗体和Tn I抗体购自福州迈新公司，FITC标记的山羊抗小鼠IgG和罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自中山生物科技公司，Annexin V+FITC凋亡检测试剂盒购自凯基生物制品有限公司。2、主要仪器BD FACSCalibur流式细胞仪（美国），Leica Tcs sp2激光共聚焦显微镜（德国），UV22101紫外分光光度计（Shimadazu公司，日本）；垂直电泳仪（美国Bio-Band公司）；转移槽（美国Bio-Band公司）；低温离心机（日本HITACHI）；Image MasterVDS（美国Pharmacie Biotech）。实验方法1、心肌细胞培养取新生大鼠心室肌，用胰酶和胶原酶消化，将细胞重悬于含10％新生牛血清的DMEM培养液。为纯化心肌细胞，采用差速贴壁分离法去除贴壁的非心肌细胞。将细胞稀释成适当浓度的细胞悬液，按5.0×105个／ml密度接种于用1％明胶铺底的90 mm培养皿。在开始的24～36 h加入100 mM溴脱氧尿苷抑制非心肌细胞增殖。2、实验分组将原代培养心肌细胞按孔随机分为五组。Con组：正常对照组，不予缺氧／复氧，而与其他组同步换液，所换培养基为无血清高糖DMEM；A／R组：缺氧复氧组，心肌细胞缺氧3 h，复氧2 h；CsA1组：心肌细胞缺氧前10 min给予1μMCsA（MPT抑制剂）；CsA2组：心肌细胞复氧前10 min给予1μM CsA)；CsA3组：心肌复氧后10 min给予1μM CsA。3、观察指标复氧2h后，采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况、Western blotting测定心肌细胞线粒体色素C释放。复氧50 min后，采用cold-loading／warm incubation方法染色线粒体，激光共聚焦显微镜成像，观察mPTP的开放情况。4、统计学处理所有数据采用均数±标准差（（?）±s）表示，应用SPSS 12.0统计软件处理，多组间比较用单因素方差分析（ANOVA），多样本均数间两两比较用最小显著差法（LSD），以P<0.05为有统计学差异。实验结果CsA1、CsA2组的细胞凋亡指数明显低于A／R组（P<0.05）。CsA3组细胞凋亡指数与A／R组无明显差异。CsA1、CsA2组胞浆Cyt c的含量明显低于A／R组（P<0.05），CsA3组与A／R组无明显差异。CsA1、CsA2组线粒体Cyt c的含量明显高于A／R组（P<0.05），CsA3组与A／R组无明显差异。CsA1、CsA2组Calcein保留在线粒体内，胞浆荧光强度较弱，提示MPT未开放。A／R、CsA3组Calcein从线粒体释放到胞浆，胞浆荧光强度较强，提示MPT开放。结论1、缺氧前和复氧前给予CsA可减少心肌细胞凋亡，保持Cyt c含量；2、缺氧前和复氧前抑制MPT可以减轻心肌细胞缺氧／复氧损伤；3、复氧后给予CsA不能抑制MPT，MPT呈不可逆状态。外周苯二氮（艹卓）受体配体参与调控大鼠心肌线粒体通透性转换的研究目的外周苯二氮（艹卓）受体（peripheral benzodiazepine receptor，PBR）最初是发现于中枢神经系统之外，之后发现大鼠的心血管系统中富集PBR，其结构和功能完全不同于中枢苯二氮（艹卓）受体（CBR），CBR和GABA受体耦联发挥镇静、抗焦虑和抗惊厥的作用。PBR是分子量为18 kDa的疏水蛋白，有5个跨膜区，含169个氨基酸的蛋白，主要位于线粒体外膜。众所周知线粒体是电子传递和细胞内生成ATP生成的位点。PBR在线粒体内高表达，最初关于PBR的功能的研究主要围绕其对线粒体呼吸的作用。PBR配体PK11195、R05-4864和其他相关的改变线粒体呼吸的复合物与其和PBR的亲合力有潜在的关系。PBR可调控线粒体膨胀，这和琥珀酸细胞膜色素C氧化还原酶活性有关。PBR参与了体内大量生理过程，如类固醇产生、线粒体呼吸、离子通道活性、免疫调节、卟啉转运、血红素合成、凋亡及细胞的增殖、应激反应等。最近研究认为PBR能通过调控VDAC／ANT的动力学进而调控mPTP，也可能是通过调控VDAC或ANT和其他调节因素如Bcl-2蛋白家族的相互作用起到调控mPTP作用。依据受体动力学特征，PK11195被定义为PBR拮抗剂，Ro5-4864为激动剂。本研究的目的是利用PBR特异性激动剂和拮抗剂探讨PBR在调控mPTP中的作用和机制。第一部分外周苯二氮（艹卓）受体拮抗剂PK11195对大鼠心肌线粒体通透性转换的影响实验材料1、实验动物及主要试剂Sprague-Dawley大鼠，200～250 g，雌雄不拘，由徐州医学院动物中心提供。1-（2-Chlorophenyl-N-methyl-1-methylpropyl）-3-isoquinolinecarboxamide（PK11195）和枯草蛋白酶购自Sigma公司，环孢菌素A（CsA）购自Fluka BioChemika公司。鼠单克隆抗Cyt c抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记标记的的抗小鼠IgG购自Cell signaling公司。JC-1荧光探针购自Molecular Probes公司。2、主要仪器UV22101紫外分光光度计（Shimadazu公司，日本）；垂直电泳仪（美国Bio-Band公司）；转移槽（美国Bio-Band公司）；低温离心机（日本HITACHI）；ImageMaster VDS（美国Pharmacie Biotech）；H-600电子显微镜（日本）。实验方法1、大鼠心肌线粒体分离制备大鼠断头处死，立即取心脏，剪取心室肌洗净血迹后置预冷的匀浆介质中，用电动匀浆器匀浆，制成20 ml／g组织的匀浆液。在冰浴中孵育5 min后。采用差速离心法分离线粒体，制成线粒体悬液（蛋白浓度约5 mg／ml）。以上所有操作均于4℃条件下进行。电镜观察证实线粒体结构完整，Bradford法进行线粒体蛋白定量，以BSA作标准。2、实验分组将线粒体分别和50，100，200μmol／L的PBR拮抗剂PK11195孵育（50，100，200μM组），部分线粒体和100μmol／L PK11195孵育之前5 min加入0.2μmol／LMPT抑制剂CsA（PK+CsA组），不给任何处理的线粒体为阴性对照（Con组），单纯给150μmol／L Ca²⁺作阳性对照(Ca²⁺组)。3、分光光度法观察MPTMPT的变化以线粒体膨胀产生的吸光度的下降来反应。取线粒体用线粒体膨胀测定液（300 mmol／L sucrose，120 mmol／L KCl，5 mmol／L KH₂PO₄ and 10 mmol／LMOPS-Tris，pH 7.4）稀释至最终蛋白质浓度为0.5 mg／ml。通过UV22101紫外分光光度计（Shimadazu公司，日本）检测线粒体的光密度在520 nm处的变化测定MPT变化，持续观察10 min。4、电镜观察线粒体形态各组线粒体处理完毕后，离心收集线粒体沉淀，放入3％戊二醛磷酸缓冲液中固定，1％锇酸后固定，用H-600电子显微镜对标本观察并在8 000倍下进行随机拍照。5、Western blot测线粒体Cyt c的释放将各处理组线粒体悬液孵育20 min后，立即加入1 mmol／L EDTA，将线粒体悬浮液置于预冷的离心管中，于4℃，12 000 g离心10 min，分别收集上清液和线粒体沉淀行Western blot，用辣根过氧化物酶标记显色试剂盒显色条带，图像分析仪进行半定量分析。6、线粒体膜电位测量利用JC-1线粒体膜电位试剂盒检测线粒体膜电位变化。当线粒体膜电位水平低时，JC-1主要以单体形式存在，呈绿色荧光；当线粒体膜电位水平较高时，形成聚合物，发出红色的荧光。激光共聚集显微镜下观察，计算平均荧光密度，以红色荧光的光密度值／绿色荧光的光密度值表示线粒体膜电位的高低，比值下降表示线粒体膜电位的下降。7、统计学处理所有数据采用均数±标准差（（?）±s）表示，应用SPSS 12.0统计软件处理，多组间比较用单因素方差分析，多样本均数间两两比较用SNK（Student-Newman-Keuls）检验。以P<0.05为有统计学差异。实验结果1、PK11195对MPT的影响50，100，200μmol／L的PK11195剂量依赖性诱发线粒体在520 nm处的吸光度下降（P<0.05，P<0.01 vs Con）。部分线粒体在给予100μmol／L PK11195之前加入MPT抑制剂CsA则阻断了PK11195诱发的线粒体在520 nm处的吸光度下降。2、PK11195对线粒体超微结构的影响Con组心肌线粒体为均匀的电子浓缩基质，脊排列整齐。Ca²⁺和PK11195处理过的线粒体损伤严重，表现出明显的空泡变性，线粒体肿胀，线粒体脊膜破裂。给PK11195之前给予CsA则可明显减轻线粒体损伤程度，大部分线粒体结构基本完整。3、PK11195对线粒体Cyt c释放的影响PK11195诱发线粒体Cyt c释放，与Con组相比，PK11195处理的线粒体胞浆（上清）Cyt c含量明显增多（P<0.01），同时伴随线粒体里的Cyt c含量显著减少（P<0.01）；但CsA阻断了PK11195的此种效应，与100μM组相比，PK+CsA组胞浆Cyt c含量明显减少（P<0.05），线粒体里Cyt c含量显著增多（P<0.05）。4、PK11195对线粒体膜电位的影响PK11195显著诱发线粒体膜电位下降，100μM组线粒体膜电位（0.34±0.09）明显低于Con组（0.94±0.23）（P<0.01）。在给予PK11195之前加入CsA则阻断了PK11195的上述作用，PK+CsA组线粒体膜电位（0.62±0.13）显著高于100μM组（P<0.05）。结论1、PBR拮抗剂PK11195在没有外源性钙离子存在的情况下也可诱发MPT；2、PBR拮抗剂PK11195诱导MPT呈剂量依赖性；3、PK11195通过诱导MPT导致线粒体超微结构损伤和线粒体Cvt c释放、膜电位下降；4、通过调控PBR可调控病理生理状态下的MPT。第二部分外周苯二氮（艹卓）受体激动剂Ro5-4864对大鼠心肌线粒体通透性转换的影响实验材料1、实验动物及主要试剂7-chloro-5-（4-chlorophenyl）-1，3-dihydro-1-metllyl-2H-1，4-benzodiazepin-2-one（Ro5-4864），苍术苷（Atractyloside，ATR）购自Sigma公司。实验动物和其他试剂同第一部分。2、主要仪器：同第一部分。实验方法1、大鼠心肌线粒体分离制备同第一部分。2、实验分组将不同浓度（50，100，200μmol／L）的外周苯二氮（艹卓）受体激动剂Ro5-4864和线粒体在室温孵育5 min（50，100，200μM组），加入150μmol／L Ca²⁺诱发MPT。不给任何处理的线粒体为阴性对照(Con组，单纯给150μmol／L Ca²⁺作阳性对照(Ca²⁺组)。另取部分线粒体和100μmol／L Ro5-4864孵育，之前5 min加入20μmol／LATR（ATR+Ro组），同样以Ca²⁺诱发MPT。3、分光光度法观察MPT同第一部分。4、Western Blot测线粒体Cyt c的释放同第一部分。5、线粒体膜电位测量同第一部分。6、统计学处理同第一部分。实验结果1、Ro5-4864对MPT的影响50，100，200μmol／L的Ro5-4864均显著抑制Ca²⁺诱发的线粒体在520 nm处的吸光度下降（P<0.05，P<0.01）。100，200μM组与50μM组比较有显著差异（P<0.05），但100μM与200μM组间比较无显著差异。100μM组与Ro+ATR组间有显著性差异（P<0.01）。2、Ro5-4864对线粒体起微结构的影响Con组心肌线粒体为均匀的电子浓缩基质，脊排列整齐。Ca²⁺组线粒体损伤严重，表现出明显的空泡变性，线粒体肿胀，线粒体脊膜破裂。Ro5-4864可明显减轻线粒体损伤程度，大部分线粒体结构基本完整。但ATR阻断了Ro5-4864的此种效应。3、Ro5-4864对Ca²⁺诱发的线粒体Cyt c释放的影响Ro5-4864显著抑制Ca²⁺诱发的线粒体Cyt c释放。与Ca²⁺组相比，100μM组胞浆（上清）Cyt c含量明显减少（P<0.01），同时伴随线粒体里的Cyt c含量显著增加（P<0.01）；与100μM组相比，ATR+Ro组胞浆Cyt c含量明显增多（P<0.05），线粒体里cyt c含量显著减少（P<0.05）；与Con组相比，Ca²⁺组胞浆Cyt c明显增多（P<0.01），线粒体里Cyt c含量显著减少（P<0.01）。4、R05-4864对线粒体膜电位的影响R05-4864可显著抑制Ca²⁺引起的线粒体膜电位下降，100μM组线粒体膜电位（0.65±0.14）显著高于Ca²⁺组（0.25±0.05）（P<0.01）。在给予100μmol／LRo5-4864之前加入20μmol／L ATR则阻断了Ro5-4864的上述作用，ATR+Ro组线粒体膜电位（0.35±0.11）显著低于100μM组（P<0.05）。结论1、PBR激动剂Ro5-4864可抑制MPT，但未见剂量依赖性；2、PBR激动剂Ro5-4864可减轻Ca²⁺诱导的线粒体损伤；3、Ro5-4864通过抑制MPT减轻线粒体超微结构损伤、Cyt c释放和膜电位下降；4、PBR参与调控MPT，为心肌线粒体功能保护提供新的治疗靶点。