研究背景：由于生活水平的提高及饮食习惯的改变,近年来我国大肠癌的发病率及死亡率均呈上升趋势。而目前大肠癌的治疗仍以手术切除为主,辅以化疗和放疗,虽然短期内有较好的疗效,但存在副作用大、对机体损伤重、复发率高等缺点,特别是对已有转移者很难取得良好的远期疗效。随着医学分子生物学研究的深入和应用,基因治疗已逐渐成为肿瘤生物治疗学的重要组成部分,并在结肠癌的治疗中显示出良好的应用前景。因此,研究针对大肠癌发生发展机制方面的治疗新策略将有望对大肠癌的治疗开辟新途径。Notch信号通路是一个在进化中高度保守的细胞间信号传递通路,由Notch受体、Notch配体(DSL蛋白)和转录因子CSL(一类DNA结合蛋白)等组成。在哺乳动物,Notch受体家族包括4个成员(Notch 1-4), Jagged1是其主要配体。Notch信号通路调控细胞的分化和增殖与凋亡,在胚胎发育和细胞命运的决定中发挥重要的作用。研究表明,Notch信号通路参与肿瘤的发生发展,Notch受体和配体分子表达失调以及Notch信号的异常激活存在于多种恶性肿瘤。但到目前为止,Notch信号在大肠癌发生发展中的作用及其机制尚不明确。研究Notch信号与大肠癌的关系是一个新的领域,并将可能为大肠癌的基因治疗提供一个新的靶点。目的：1.探讨Notch1及Jagged1蛋白在大肠肿瘤中的表达特点及其与大肠癌的临床病理学特点的关系。2.检测大肠癌细胞系的Notch1蛋白和mRNA表达情况,筛选Notch1基因高表达的细胞系。3.探讨Notch信号的阻断对大肠癌细胞增殖和凋亡的作用及其可能的机制。材料和方法：1.研究材料：①临床标本：大肠癌标本77例,大肠腺瘤标本32例,癌旁组织31例,正常对照大肠组织31例；②大肠癌细胞系：COLO205、HT29、LoVo、SW480及SW1116。2.大肠癌组织及细胞的Notch信号通路相关蛋白的检测：采用免疫组织(细胞)化学PV-9000方法及Western blotting方法。3.大肠癌细胞Notch信号通路相关基因mRNA的检测：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法。4.大肠癌细胞Notch信号的调控：采用RNA干扰(质粒pSiRNA-Notch1)及特异性抑制剂DAPT阻断的方法。RNA干扰实验分组：①未干扰组(生理盐水)；②阴性对照组(阴性对照病毒上清)；③干扰组(含pSiRNA-Notch1病毒上清)。DAPT实验分组：MTT设DAPT浓度为6.25、12.5、25、50μM 4个浓度梯度,以DMSO作阴性对照；根据MTT结果,其后分为①25μM DAPT处理组；②50μM DAPT处理组；③阴性对照组。5.细胞增殖的检测：采用四唑蓝(MTT)比色试验。6.细胞周期的检测：采用PI染色流式细胞术方法。7.细胞凋亡的检测：采用Annexinⅴ/PI双染色流式细胞术及TUNEL方法。结果：1.Notch1受体和Jagged1配体分子在人大肠癌组织中的表达：(1) Notch1受体分子在正常大肠组织、癌旁组织、大肠腺瘤及大肠癌中均有阳性表达,并呈递增趋势,阳性率分别为22.6%、19.4%、78.1%和89.6%；且大肠癌及腺瘤的表达显著高于正常大肠组织及癌旁组织(P=0.000),而大肠癌与腺瘤之间,癌旁与正常大肠组织之间的表达无显著差别(P>0.05)。(2)配体Jagged1分子在正常大肠组织、癌旁组织、大肠腺瘤和大肠癌中均有阳性表达,也呈递增趋势,阳性率分别为12.9%、12.9%、81.2%和85.7%；且大肠癌及腺瘤的表达显著高于正常大肠组织及癌旁组织(P=0.000),而大肠癌与腺瘤之间,癌旁与正常大肠组织之间表达无显著差异(P>0.05)；中高分化大肠癌Jagged1表达(83.05%)显著低于低分化大肠癌(94.44%,P=0.001),分化程度越低,Jagged1的表达越高,两者呈负相关(rs=-0.355,P=0.002)；Dukes(A+B)期Jagged1表达(76.32%)显著低于Dukes(C+D)期(94.87%,P=0.029)；从DukesA期到D期,表达逐渐增高,两者呈正相关(rs=0.385,P=0.001)；有淋巴结转移者Jagged1的表达(94.44%)显著高于无淋巴结转移者(78.05%,P=0.031),两者也呈正相关(rs=0.246,P=0.03)。(3) Notch1受体分子与Jagged1配体分子在大肠癌中的表达呈正相关(rs=0.305,P=0.007)。2. Notch1蛋白和mRNA在大肠癌细胞系中的表达：免疫细胞化学方法显示Notch1受体分子在5种大肠癌细胞系中均有表达,但各细胞系间无显著差别(P>0.05)；Western blotting及RT-PCR法分别检测发现,Notch1蛋白及mRNA在5种大肠癌细胞系中均有不同程度的表达,其中COL0205、HT29、SW480及SW1116均为相对高表达,而LoVo细胞则呈相对低表达；本研究选择Notch1相对高表达的HT29细胞进行后续实验。3.表达pSiRNA-Notch1基因的逆转录病毒的鉴定和制备：(1) pSiRNA-Notch经PCR及酶切鉴定,基因测序均证明插入片段正确；(2)制备的pSiRNA-Notch1重组逆转录病毒滴度达234×104CFU/ml,阴性对照病毒滴度为185×104CFU/ml。4. pSiRNA-Notch1对HT29细胞的影响：(1)对Notch1 mRNA表达的影响：pSiRNA-Notch1作用于HT29细胞72h,干扰组HT29细胞Notch1 mRNA表达水平较阴性对照组和未干扰组显著下降(P<0.05),而阴性对照组和未干扰组间则无明显差别(P>0.05)；(2)对细胞形态的影响：倒置显微镜下观察,干扰Notch1信号72h后HT29细胞出现细胞轮廓欠清晰,边缘不光滑、毛糙等明显的形态学改变；(3)对细胞生长的影响：MTT法发现,pSiRNA-Notch1作用24h,干扰组与未干扰组和阴性对照组之间OD490nm值无明显差别(P>0.05),但48h、72h及96h其OD490nm值较未干扰组和阴性对照组明显下降,生长抑制率显著升高(P=0.000),而未干扰组和阴性对照组之间各时间点均无差别(P>0.05)；(4)对细胞周期的影响：pSiRNA-Notch1作用于HT29细胞48h,与未干扰组及阴性对照组比较,干扰组G1期细胞显著增多(P<0.01),而未干扰组与阴性对照组间无差别(P>0.05)；(5)对细胞凋亡的影响：pSiRNA-Notch1作用于HT29细胞48h,与未干扰组与阴性对照组比较,干扰组细胞凋亡显著增加(P<0.05),而未干扰组与阴性对照组间无差别(P>0.05)：(6)对p21及PUMA mRNA表达的影响：pSiRNA-Notch1作用72h,与未干扰组及阴性对照组比较,干扰组细胞p21及PUMA mRNA表达水平均显著升高(P<0.01),而阴性对照组和未干扰组之间无显著差别(P>0.05)。5. DAPT对HT29细胞系的影响：(1)对细胞形态的影响：倒置显微镜下观察,DAPT作用于HT29细胞48h后出现细胞分散、胞体变圆和突起延长等明显的形态学改变；(2)对细胞生长的影响：与阴性对照组相比,50μM的DAPT处理24h、25μM的DAPT处理72h、12.5μM的。DAPT处理96h后,均发现HT29细胞的生长显著减慢(P<0.01,0.05),随着药物处理时间的延长,其生长抑制作用更加明显(P<0.01),而6.25gM的DAPT抑制效果不明显(P>0.05)。DAPT呈时间、浓度依赖的方式影响HT29细胞的生长。根据MTT结果,本研究选择25μM及50μM的DAPT进行后续实验；(3)对细胞周期的影响：与阴性对照组比较,25μM及50gM的DAPT作用48h后,HT29细胞G1期均明显增多(P<0.01),且随DAPT浓度升高,G1期细胞增加更明显(P<0.05)；(4)对细胞凋亡的影响：与阴性对照组相比,25μM的DAPT处理48h后HT29细胞凋亡明显增加(P=0.000),且随着DAPT浓度的增加,凋亡细胞增多更明显(P=0.000)。结论：1.Notch1受体及配体Jagged1蛋白在大肠组织癌变过程中表达逐渐增加,提示Notch1及Jagged1的表达与大肠癌癌变的发生和发展有关。Notch1信号在多种大肠癌细胞系中均有不同程度的表达,进一步证实Notch信号与大肠癌的发生和发展有关。2. Jagged1在大肠癌组织中的表达与其病理分化程度呈负相关,与大肠癌的Dukes分期及淋巴结转移呈正相关,提示Jagged1与大肠癌恶性程度及预后有关。3. Notch1的siRNA和Notch信号抑制剂DAPT均能抑制大肠癌细胞的增殖,促进细胞凋亡。DAPT以浓度及时间依赖方式抑制大肠癌细胞HT29的生长,使细胞周期阻滞于G0-G1期,促进细胞凋亡。4. Notch1信号的下调抑制大肠癌细胞的增殖,可能通过诱导p21及PUMA的表达上调从而阻滞细胞周期进展,促进细胞凋亡