论文部分内容阅读
背景与目的： 大量研究证实，硒在超营养水平能阻止多种肿瘤的发生发展。亚硒酸钠是一经典的硒制剂，虽有抗癌作用，但细胞毒性较强。因此，筛选低毒高效的硒化合物是学者们致力探索的课题。研究表明，硒甲基化能降低硒的毒性，而且部分甲基化形式的硒化合物具有更强的抗肿瘤作用。硒-甲基硒代半胱氨酸(Se-methylselenocysteine，MSC)是富硒大蒜的提取物，是甲基硒的重要前体物质。初步研究发现，它对人早幼粒白血病细胞有较强的诱导凋亡能力和较低的细胞毒性，显示出良好的发展前景。但MSC在实体瘤方面的研究尚少，在食管癌的研究方面尚未见文献报道，因此，本实验以食管癌细胞系H5E973、EC109和EC8712为靶细胞，以亚硒酸钠为对照，对MSC进行以下研究：1、比较MSC和亚硒酸钠的细胞毒性作用和诱导凋亡能力，观察MSC是否具有比亚硒酸钠更低的毒性和更强的诱导细胞凋亡作用。2、研究两者对上述细胞系在细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和Bcl-2、Bax、PCNA表达等方面的影响，探索它们可能的抗肿瘤作用机制。 材料和方法： 按常规培养H5E973、EC109和EC8712食管癌细胞，将其分为对照组和不同剂量的加硒组。将对数生长期细胞分别接种于培养瓶及培养板中，加入不同浓度的MSC和亚硒酸钠。在HSE973细胞系，两者的浓度均分别为：0.1μg／ml、1.0μg／ml、2.0μg／ml、4.0μg／ml和 汕头大学医学院硕士学位论文8.0昭/m1。在H5E973细胞系实验的基础上，选择亚硒酸钠浓度为1.0林g/ml、2.0林g/ml和4.0林g/ml，Msc浓度为2.0林g/ml、4.0林g/ml和8.0林g/ml，在EC109和EC8712细胞系进行重复实验。对照组以生理盐水替代硒化合物。应用光学显微镜、透射电镜、流式细胞仪、TUNEL、免疫组织化学等手段，观察分析食管癌细胞在不同浓度的MSC和亚硒酸钠作用后的形态学改变、细胞周期变化、诱导细胞凋亡的作用和凋亡相关蛋白Bax和Bd一2的表达。结果:一、细胞的形态学变化:1.倒置显徽镜下活细胞观察:在H5E973细胞，0.1林g/m 1 MSC和亚硒酸钠组细胞形态无明显改变。亚硒酸钠浓度为1.0林g/m1和2.0陀/m1时，除见部分细胞体积缩小，胞浆胞核浓缩外，还见部分细胞出现胞浆空泡及颗粒样物质增多等毒性改变。随硒剂量增加，细胞毒性改变更趋明显，8.0林留ml组，大部分细胞己崩解漂浮。MSC浓度为1.0林g/ml和2.0林g/m1时，细胞密度下降，部分细胞体积缩小，胞膜和核膜增厚，折光性增强，轮廓更加清晰，细胞贴壁能力下降。随MSC浓度增加，上述形态学改变增多，细胞密度进一步下降，漂浮细胞增多，但即使浓度达8.0林g/m1，细胞仍未见明显的毒性改变。EC 1 09和EC8712细胞的改变与H5E973细胞类似。HE染色光学显徽镜观察:在H5E973细胞系，0.1林g/m 1 MSC和亚硒酸钠组，细胞形态无明显改变。亚硒酸钠浓度为1.0林g/m1和2.0陀/m1时，细胞密度下降，见较多散在的凋亡样细胞，但同时部分细胞已出现肿胀变圆、胞浆空泡增多等毒性改变。随亚硒酸钠浓度增加，细胞毒性变化更趋明显。1.0林glml和2.0林g/mlMsc组，细胞密度下降，见部分细胞呈凋亡形态学改变，其余细胞形态无明显改变，随着MSC浓度增加，凋亡细胞增多，细胞密度进一步下降，但即使浓度达8.0林g/ml，细胞仍未见明显的毒性改变。EC109和EC8712细胞也出现类似H5E973细胞的改变。 汕头大学医学院硕士学位论文2.透射电镜观察: 在H5E973细胞，NZ.O组，可见凋亡细胞，但大多细胞呈现明显的毒性改变:细胞肿胀，胞浆内空泡增多(主要为线粒体肿胀扩张)，细胞膜及细胞器膜损伤明显，形成髓鞘样结构，甚至破裂，内容物外溢，细胞坏死。N4 .0组的细胞毒性改变更加明显。M8.0组，部分细胞呈凋亡形态学改变:细胞体积缩小，胞浆浓缩，电子密度增高，核染色质聚集成块，边集于核膜下，有的细胞表面见许多泡状突起，脱落后形成凋亡小体，见部分凋亡小体被邻近的细胞吞噬。EC 1 09也出现与H5E973细胞类似的改变。二、细胞生长抑制指标观察1.细胞生长曲线:对照组的生长曲线随时间延长呈显著上升趋势。各浓度MSC和亚硒酸钠组的生长曲线均明显低于对照组。其中，各浓度MSC组的生长曲线的下降趋势均不如相应浓度的亚硒酸钠组明显。2.细胞分裂指数(MD:各加硒组的细胞分裂指数均明显低于其相应对照组(P均<0.01)，并呈时间和剂量依赖性降低。三、流式细胞仪检测:1.DNA倍体分析:三个细胞系，对照组在二倍体峰前均未见亚二倍体峰(凋亡峰，Ap)，各加硒组，在流式细胞仪DNA直方图上均见亚二倍体峰。 在H5E973细胞中，MSC组，Ml.O时出现清晰的亚二倍体峰。随着硒浓度的递增，亚二倍体峰逐渐攀高，即使浓度达MS，0时，该峰仍有上升趋势。亚硒酸钠组，Nl.0时亦可见清晰的亚二倍体峰，且略高于同剂量的MSC组。N2.0的亚二倍体峰与M2.0相近，但二倍体峰低平。N4 .0的亚二倍体峰不但低于N2.0，而且也不如M4