应用转基因斑马鱼研究miRNA参与心肌肥厚和维生素影响血管新生的功能与机制斑马鱼是目前研究器官发育和疾病发生的常见模式动物之一，广泛应用于生命科学研究的各个领域，具有以下优点：1)体外受精、胚胎透明，易于进行胚胎和遗传学操作；2)发育快速、性成熟周期短、产卵量大；3)基因组序列的测序基本完成，与人类高度保守。在心血管系统疾病的研究中，斑马鱼被广泛应用，一方面可以通过基因操作技术探讨特定基因在心血管发育和疾病发生中的作用;另一方面，斑马鱼可以作为大规模活性物质的筛选平台。本课题利用斑马鱼作为模式动物，从这两方面探讨斑马鱼在心血管系统疾病发生和活性物质筛选中的应用。1) MicroRNA（miRNA）是近年来发现的一类通过抑制转录对靶基因进行负调控的小分子非编码RNA。多项研究发现miRNA在心肌肥厚的病理生理过程中表达异常，并对心肌肥厚起促进或抑制作用。本课题通过建立心脏特异的miRNA转基因斑马鱼平台来评估miRNA在心肌肥厚中的作用。2)维生素作为微量物质在各种生理过程中发挥着至关重要的作用。然而，近年来多项研究发现某些药物剂量的维生素对心血管的发育具有影响。本课题通过建立小分子活性物质功能斑马鱼筛选平台来筛选维生素对于血管发育的影响。第一部分利用转基因斑马鱼平台评估miR-22和miR-24对心肌肥厚的影响心肌肥厚是一种对于心脏超负荷工作的适应性反应，是导致慢性心衰的重要原因之一。MiRNAs在这一病理过程中的作用机制成为近几年研究的热点之一。一、目的：利用心肌细胞特异转基因斑马鱼平台评估miR-22和miR-24在心肌肥厚中的作用，并探索心肌细胞特异转基因斑马鱼在心肌肥厚研究中的应用。二、方法：1、心肌细胞的培养及肥大模型的建立取出生2天的SD乳鼠心室，用D-Hanks洗涤心脏，将心室剪成1mm3左右的组织碎块，胰酶消化后收集细胞，并细胞计数后,接种于12孔板培养。DMEM培养液常规培养48小时后，进行无血清培养24小时。然后以10uM的苯肾上腺素或5uM的血管紧张素II刺激细胞48小时后，进行细胞表型观察和RNA、蛋白分析。2、细胞免疫荧光染色将心肌细胞接种于载玻片上，4%多聚甲醛固定20min，PBS清洗3次，每次15min。10％BSA封闭10min后，稀释好的α-actinin抗体室温孵育12h,用含0.1％吐温20的PBS室温洗三次，每次10min。用荧光标记的二抗，室温避光温育2min,用含0.1％的吐温20的PBS室温洗三次，每次10min,荧光显微镜下观察摄像。3、过表达miRNA的腺病毒载体的构建与转染将miRNAs前体序列PCR扩增后克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒。穿梭质粒经酶切线性化后，电转BJ5183感受态菌，以获得重组质粒。重组质粒线性化后，脂质体转染293细胞，常规细胞培养至细胞变圆或成葡萄串珠状时，弃上清，冻融细胞，获得第一代病毒。按10ifu的滴度转染293细胞，待其变圆后，将其从培养瓶底吹下，离心弃上清，重悬细胞，反复冻融三次。离心弃沉淀，上清经CsCl密度梯度离心获得较高滴度的病毒液，10倍梯度稀释后，转染293T，观察绿色荧光确定病毒滴度。腺病毒以50MoI、100MoI滴度转染心肌细胞，荧光显微镜下计数绿色荧光细胞的百分数，以确定转染效率；通过定量PCR和Northern blot检测miRNA表达量以确定病毒的表达效率。4、MiRNA反义序列的设计及沉默效率分析Mirbase获得miRNAs成熟序列，设计其反义互补序列，进行碱基的2′甲氧修饰，化学合成。将siRNA转染心肌细胞，孵育48小时，RNA抽提，定量PCR和Northern blot检测，确定其对miR-22及miR-24的沉默效率。5、斑马鱼心脏特异转基因质粒的构建将miRNAs前体序列PCR扩增后连接至pMD-18T载体。然后，将连接产物转化至DH5α感受态中并培养摇菌后抽提质粒。用NcoI和EcoRI酶切重组质粒及pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因载体，然后将miRNA前体片段在T4DNA连接酶作用下连接酶切后的Tol2质粒，后转化至DH5α感受态中，培养后抽提质粒，并进行酶切鉴定和基因测序。6、MiRNA心肌特异转基因斑马鱼系的构建将配制好注射用的重组转基因质粒及转座酶mRNA加入显微注射针。将刚产下的斑马鱼卵转移至琼脂糖平板内的凹槽中，并将多余的水分吸走同时又要避免鱼卵过于干燥。调节显微注射仪上的调节钮设置注射的时间、压力等指标。一般以单细胞期胚胎进行注射效果最佳，每枚鱼卵被注射的量大约为4nL。注射完成后，将胚胎轻轻移至孵化水中放入培养箱中培养。胚胎发育到48小时，体视荧光显微镜下，观察绿色荧光在斑马鱼心脏部位的表达，并挑选阳性胚胎进行饲养，成年后杂交及胚胎筛选。三、结果:1、心肌细胞肥大模型的建立心肌细胞培养2天后聚集成簇，并出现同步化搏动，在苯肾上腺素及血管紧张素Ⅱ的诱导下收缩蛋白合成增多，心肌细胞表面积增大。显微镜下观察对照组心肌细胞呈较小的三角形；苯肾上腺素或血管紧张素Ⅱ处理组心肌细胞呈饱满三角形或圆形，且细胞明显肥大。2、过表达和抑制miR-22对心肌细胞肥大的影响通过大鼠心肌细胞转染miR-22模拟物来实现miR-22的过表达。MiR-22模拟物转染心肌细胞48小时后，应用实时定量PCR分析miR-22的表达量，发现miR-22的表达量明显升高。与对照组相比转染了miR-22模拟物的心肌细胞明显增大。利用miR-22抑制物实现内源性miR-22表达的下调。MiR-22抑制物被转染至心肌细胞48小时后，通过实时定量PCR分析发现内源性miR-22明显下降。通过实验发现与对照组相比，实验组心肌细胞表面积明显降低，表明miR-22的降低抑制苯肾上腺素及血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大。3、抑制miR-24对心肌细胞肥大的影响利用miR-24抑制物转染苯肾上腺素诱导的肥大心肌细胞，从而实现内源性miR-24表达的下调。MiR-24抑制物被转染至心肌细胞48小时后，实时定量PCR分析表明内源性miR-24明显下降。通过免疫荧光和表面积测量实验，发现与对照组相比实验组心肌细胞表面积明显降低，表明miR-24的降低能够抑制苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大。4、成功构建心肌特异miRNA转基因斑马鱼平台通过质粒重组技术构建了包含miR-22和miR-24的pTol2-CMLC2-miRNA-IRES-EGFP斑马鱼转基因载体，并且经过酶切鉴定以及基因测序后证明重组质粒构建成功。将miR-22和miR-24转基因质粒及转座酶mRNA分别显微注射入单细胞期斑马鱼胚胎，胚胎发育48小时后体视荧光显微镜下观察到斑马鱼心肌组织出现绿色荧光。阳性斑马鱼胚胎饲养成年后，其子代胚胎观察到心肌组织中表达绿色荧光蛋白，表明心肌特异miRNA转基因斑马鱼系构建成功。目前miR-22和miR-24在心肌肥厚中的功能在该转基因斑马鱼模式动物中做进一步研究。四、结论:1、MiR-22在心肌细胞中过表达，能够促进心肌细胞肥大。2、MiR-22和miR-24的降低抑制苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大。3、成功构建心肌特异miRNA转基因斑马鱼平台,并可以此为平台研究miRNA对心脏功能的影响。第二部分利用血管内皮特异绿色荧光蛋白转基因斑马鱼研究维生素对于血管新生的影响转基因斑马鱼的另一个重要应用是可进行大规模的小分子活性物质筛选。维生素是维持正常生理功能所必需的一类微量物质，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。已经有文献报道维生素对于血管新生具有促进或者抑制作用。本部分利用转基因斑马鱼在体水平筛选影响血管发育和新生的维生素。一、目的：利用内皮细胞特异转基因斑马鱼平台评估维生素对于血管发育和新生的影响。二、方法：1、实验动物内皮细胞特异转基因斑马鱼系Tg（flk1：EGFP）在斑马鱼培养系统中培育，3个月后开始驯化产卵。2、鱼卵收集实验前一天下午，将斑马鱼雄鱼与雌鱼按照1:1比例放入产卵槽中，在产卵槽底部放置网状结构，产卵槽中间放置隔板。然后将放入斑马鱼的产卵槽盖布避光。第二日揭开遮光布、拿掉隔板，让雌鱼与雄鱼交配。受精卵形成后10分钟内将胚胎收集于培养皿内，放置于智能光照培养箱内孵化2小时。3、不同浓度维生素的配制根据Westerfield方案配制鱼卵水(egg water，137mmol/L NaC1，5.4mmol/L KC1，0.13mmol/L Ca2C1，0.1mmol/L Mg2+，pH7.2)，将不同的维生素溶入二甲亚砜(DMSO)终浓度为0.5%的鱼卵水中，配制成不同浓度。4、斑马鱼鱼卵处理将2hpf斑马鱼胚胎放入24孔板，每孔中至少20个胚胎，加入不同浓度的各种维生素，形成药物的不同浓度梯度。实验组每孔加入上述不同浓度维生素3ml，对照组每孔加入含0.5%DMSO的鱼卵水。从受精卵形成后2h开始刺激，持续20h后观察斑马鱼节间血管的发育情况。5、药物效应的评估不同浓度的维生素处理20小时后，将斑马鱼卵剥壳然后4%多聚甲醛固定，然后在荧光显微镜下观察节间血管的变化，并测量节间血管的长度。6、统计学处理所有实验均重复至少三次，计算节间血管的平均长度，应用统计分析软件SPSS14.0进行统计学分析，实验结果以均数±标准差表示。采用t检验计算组间差异，P<0.05表明差异具有统计学意义。三、结果：1、不同浓度的维生素K1对斑马鱼血管发育的影响为了研究维生素K1对于血管发育的影响,将维生素K1的配制成3种不同浓度：12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml,使用不同浓度的维生素K1浸泡2hpf的斑马鱼胚胎20小时后，荧光显微镜下观察斑马鱼节间血管的发育并测量其长度。维生素K1处理后斑马鱼节间血管平均长度按维生素K1浓度由低到高分别为28.820±8.426μm、26.009±13.083μm、23.433±13.607μm，对照组斑马鱼节间血管平均长度为40.718±3.954μm。维生素K1处理组与对照相比节间血管长度明显减少，且差别具有统计学意义，而且随着维生素K1浓度的升高斑马鱼节间血管长度随之降低。2、维生素C、B1B和BB6对斑马鱼血管发育的影响为了研究这三种维生素对于血管发育的影响,将维生素C配制成3种浓度：250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml,将维生素B1B和BB6配制成3种浓度为：25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。将这些不同浓度的维生素分别处理斑马鱼胚胎20小时后，荧光显微镜下观察节间血管的发育并测量其长度。结果显示维生素C、B1B和BB6处理后的斑马鱼节间血管的长度与对照组相比无明显差异。四、结论：1、维生素K1抑制血管新生。2、维生素C、B1B和BB6对血管新生无影响。总结：本课题在细胞实验中发现两种可能参与心肌肥厚功能调节的miRNA，miR-22和miR-24。本课题进一步建立了两种miRNA的心肌特异转基因斑马鱼系，并将利用这一平台探讨二者在心肌肥厚中的作用。另一方面，本课题利用血管内皮特异绿色荧光蛋白转基因斑马鱼研究了维生素对于血管新生的影响，发现维生素K1抑制血管新生。