肝脏疾病是临床最常见最具危害性的疾病之一,其发病机制和防治策略的研究一直备受关注。已有的研究结果表明免疫性肝损伤在各类肝脏疾病的发生、发展过程中发挥重要作用,但其确切的病理生理机制尚未完全阐明。刀豆蛋白A(Concanavalin A, Con A)诱导的急性肝损伤模型是研究免疫性肝损伤发生机制及进行抗肝病药物筛选的经典模型之一。该模型主要机制是通过向肝脏招募并激活多克隆T细胞(尤其是CD4+T细胞),使其释放多种炎性细胞因子,进而导致肝细胞损伤。G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(G protein-coupled receptor kinase interacting proteins 2, GIT2)是一种信号支架蛋白,属于Arf GAPs家族成员。GIT2蛋白在进化上高度保守,人和小鼠GIT2的同源性为86%,人和鸡GIT2的同源性为89%。GIT2组织分布广泛,在心脏、脑、脾、肺、肾、胸腺、肝、肌肉、睾丸等中均表达,且随着年龄的增加,表达水平亦相应增加。GIT2主要参与肌动蛋白细胞骨架组装,并在整合素介导的细胞粘附、胞内信号传递过程中发挥调节作用。此外,文献还报道GIT2敲除小鼠的成骨细胞数量降低,功能受损,虽然破骨细胞数量不变,但其功能也受损,同时伴有精神焦虑等行为异常。近期研究表明GIT2在免疫系统也发挥重要作用。缺乏C端结构域的GIT2剪接体主要存在于免疫细胞中,GIT2敲除小鼠具有多种免疫缺陷症状。GIT2缺失还抑制中心粒细胞趋化功能,并以PAK1-αPIX-GIT2复合体形式参与免疫突触形成,促进T细胞对抗原的识别能力,使其活化和增殖,从而参与机体的细胞免疫反应和体液免疫反应。另有研究发现GIT2缺失会阻碍CD4+CD8+T细胞向CD4+T细胞发育。综上所述,GIT2通过参与CD4+T细胞单阳选择以及免疫突触的形成,在T细胞发育和活化过程中发挥重要作用,提示我们GIT2在机体的天然免疫和获得性免疫系统中可能具有重要调控作用。鉴于GIT2在T细胞发育、活化过程中的重要作用,我们推测GIT2可能在免疫性肝损伤中发挥某些特定的免疫调节功能。本课题引进了GIT2敲除小鼠,并对其表型进行研究,采用Con A模型,探讨了GIT2在免疫性肝损伤中的作用及相关机制,以期为临床治疗免疫性肝损伤提供新的治疗策略和药物靶点。同时,鉴于肝损伤的病因复杂多样,本课题还初步探讨了GIT2在CC14、D-GalN/LPS诱发的肝损伤模型和肝部分切除术中的作用,以期对GIT2在肝损伤中的作用进行全面系统的分析研究。一、GIT2-/-小鼠的鉴定及表型分析自日本大阪生物科学研究所引进杂合子(GIT2+-/-)小鼠交配繁殖后,采用PCR和Western Blot方法分别从DNA和蛋白质水平上对纯合子(GIT2-)小鼠进行鉴定,结果表明GIT2基因敲除小鼠交配成功。GIT2+/-小鼠子代基因型符合孟德尔遗传定律,成年GIT2-/-小鼠外观未见明显缺陷性表型,具有生育能力,提示GIT2对于胚胎发育不是必须基因。分析8周龄GIT2-/-鼠发现脾脏显著增大(t=5.650,P=0.001),肝脏、胸腺、肾和心脏指数未见明显异常；病理学检查发现GIT2-/-小鼠肝脏组织结构正常,脾脏出现红髓明显增生,局部髓样化生改变,不成熟造血细胞增加,白髓淋巴滤泡轻度萎缩等病理变化；血常规和肝功能指标检测结果显示,GIT2-/-小鼠的血常规和肝功能正常；Agilent 60K的小鼠全基因表达谱芯片检测GIT2-/-小鼠肝脏基因表达发现,差异基因在代谢、氧化还原、磷酸化、凋亡、离子转运、转移酶活性、氧还酶活性、ATP结合、水解酶活性、锌离子结合功能方面显著富集,另外差异基因与固有免疫、T细胞和B细胞的活化及分化、巨噬细胞的调节以及炎性因子的分泌也相关。这些结果表明GIT2可能在肝脏的代谢解毒、糖原合成、蛋白质合成、能量供应、抗氧化功能、离子代谢功能以及免疫调控等方面具有一定作用。流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏、淋巴结以及肝脏组织中的淋巴细胞组成,结果发现除GIT2-/-小鼠肝脏中的CD4-T细胞比例显著降低(t=9.210,P=-0.000),CD8+T细胞比例显著增高(t=5.707,P=0.001)外,各组织中其他淋巴细胞组成比例未见明显异常。对脾脏和肝脏淋巴细胞绝对计数发现,GIT2-/-小鼠脾脏CD4+、CD8+T细胞和B细胞数量显著增多(t=3.880,P=0.018； t=5.804,P=0.004；t=6.631,P=0.003)；肝脏CD4+T细胞数量显著减少(t=14.208,P=0.000),而CD8+T细胞数量显著增多(t=3.833,P=0.003)。上述结果表明我们成功引进繁殖GIT2-/-小鼠且可育,其表型与文献报道基本一致,但肝脏T细胞亚群分布异常未见文献报道,且提示GIT2在肝脏的代谢、抗氧化性和免疫调节过程中可能发挥重要功能。二、GIT2缺失对Con A诱导肝损伤的保护作用为了探讨GIT2与肝病发生和发展的关系,我们检测了50例肝病患者(包含10例乙型肝炎患者、11例活动性肝硬化患者和29例肝硬化患者)肝组织中GIT2的表达水平,结果发现GIT2在50例肝病患者以及其中21例乙型肝炎病毒感染患者(含乙型肝炎患者和活动性肝硬化患者)肝脏中的表达较正常对照组增加(Z=3.223,P=0.001；Z=2.261,P=0.024),但在乙型肝炎患者、活动性肝硬化患者和肝硬化患者间肝组织中的GIT2表达无显著性差异；GIT2在50例肝病患者肝脏细胞核中表达增加,以肝硬化入核表达最高。这些结果表明GIT2在肝病患者肝脏组织中的表达增加。为进一步研究GIT2与免疫性肝损伤的关系,我们采用Real-time PCR和Western Blot方法检测了Con A (15mg/kg)尾静脉注射对GIT2+/+小鼠肝脏GIT2表达的影响,结果发现Con A处理显著诱导GIT2 mRNA和蛋白质表达水平,提示GIT2可能在Con A所致免疫性肝损伤中发挥作用。鉴于以上研究结果,我们研究了GIT2缺失对Con A致肝损伤的影响。对小鼠存活率、血清转氨酶(ALT、AST)及病理学检测发现,GIT2缺失显著提高致死剂量ConA处理后小鼠的存活率,显著降低血清ALT、AST的升高水平(ALTt3h=25.866,P3h=0.000；t6h=18.331,P6h=0.000；t1zh=36.621,P12h=0.000；t24h=32.017,P24h=0.000；ASTt3hh=6.328,P3h=0.003；t6h=7.377,6h P=0.002；t12h=20.522,P12h=0.000；t24h=67.625,P24h=0.000),显著减轻肝脏病变,即肝脏坏死面积显著减少(t=4.362,P=0.045)。TUNEL凋亡检测结果发现,GIT2缺失显著减少肝脏细胞凋亡(t=6.621,P=-0.003)。这些结果表明GIT2缺失显著增强小鼠对ConA的耐受性,提示GIT2缺失对Con A诱导的免疫性肝损伤具有保护作用。pCMV-myc-GIT2质粒尾静脉高压注射GIT2-/-小鼠回转GIT2,24h后检测GIT2-/-小鼠肝脏发现GIT2成功表达。肝功能和病理学检测发现,回转GIT2的GIT2-/-小鼠在Con A处理后,血清ALT、AST增加水平显著高于对照组(t=6.804,P=0.002；t4.677,P=0.001),肝脏凝固性坏死面积也显著增多(t=4.023,P=0.016),该结果表明回转GIT2能够逆转GIT2-/-小鼠对Con A诱导免疫性肝损伤的耐受,进一步证实GIT2缺失对Con A诱导的免疫性肝损伤具有保护作用。三、GIT2缺失对Con A诱导免疫性肝损伤的保护机制基于GIT2-/-小鼠对Con A诱导免疫性肝损伤表现出显著、明确的耐受能力。我们进一步探讨GIT2在Con A诱导免疫性肝损伤中的作用机制。首先,采用流式细胞术检测肝脏单个核细胞(MNC)数量和各种免疫细胞浸润,结果发现,Con A处理后,GIT2-/-小鼠肝脏MNC的增多数量显著少于GIT2+/+小鼠；GIT2-/-小鼠肝脏多数免疫细胞的增多数量也显著少于GIT2+/+小鼠,而GIT2-/-小鼠肝脏CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞比例显著高于GIT2+/+小鼠。该结果提示,GIT2缺失可能阻滞Con A诱导的免疫细胞向肝脏组织浸润,同时促进具有免疫抑制功能的CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞浸润,从而发挥对Con A诱导免疫性肝损伤的保护作用。其次,采用胞内染色方法、CBA方法和Real-time PCR方法分别检测CD3+T细胞胞内炎性细胞因子、血清中的炎性细胞因子和肝脏炎性细胞因子mRNA水平,结果表明Con A诱导后1h,GIT2-/-小鼠肝脏CD3-T细胞产生的炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-4低于GIT2-/+小鼠；Con A诱导后3h、6h,GIT2-/-小鼠血清中的促炎细胞因子显著低于GIT2+/+小鼠(TNF-α t3h=3.707,P3h=0.014；t6h=2.874,P6h=0.035；IFN-γ t3h=7.132,P3h=0.002；t6h=8.480,P6h=0.009；IL-2t3h=8.096,P3h=0.000；t6h=2.989,P6h=0.017；IL-4 t3h=16.817,P3h=0.002；IL-6t3h=4.430,P3h=0.003；t6h=6.103,P6h=0.004；IL-17At3h=5.967,P3h=0.004),而对炎症有保护作用的细胞因子IL-10显著高于GIT2+/+小鼠(t3h=3.474,P3h=0.018；t6h=3.699,P6h=0.021)；ConA诱导后3h、6h,GIT2-/-小鼠肝脏组织中促炎细胞因子mRNA水平也显著低于GIT2+/+小鼠,而抑炎细胞因子IL-10]mRNA水平高于GIT2+/+小鼠。该结果提示,GIT2缺失能够下调促炎细胞因子、上调抑炎因子,从而发挥对Con A诱导免疫性肝损伤的保护作用。最后,鉴于Con A诱导免疫性肝损伤是由T细胞介导,尤以其亚群CD4+T细胞介导为主,我们分别从GIT2-/-和GIT2+/+小鼠脾脏中分选出CD3+和CD4-T细胞,Con A体外刺激,检测其活化、增殖及炎性细胞因子表达的变化。结果表明,Con A体外刺激24h后,GIT2-/-的CD3+和CD4+T细胞的活化(CD69)低于GIT2+/+的CD3+和CD4+T细胞；Con A体外刺激48h后,GIT2-/-的CD4+T细胞分泌的炎性细胞因子显著少于GIT2+/+的CD4+T细胞(TNF-α t1μg/ml=48.050, P1μg/ml=0.000;t2.5μg/ml=26.201,P2.5μg/ml=0.000;t5μg/ml=16.986,P5μg/ml=0.000;IFN-γ t2.5μg/ml=3.064,P2.5μg/ml=0.038;t5μg/ml=5.470,P5μg/ml=0.005;IL-2 t5μg/ml=5.301, P5μg/ml=0.006;IL-4 t2.5μg/ml=5.783,P2.5μg/ml=0.004;P5μg/ml=7.619,P5μg/ml=0.015; IL-6 μg/ml=19.756,P1μg/ml=0.000;IL-10 μg/ml=7.080,P1μg/ml=0.002;t2.5μg/ml= 19.086,P2.5μg/ml=0.000;t5μg/ml=7.645,P5μg/ml=0.002;IL-17A t1μg/ml=9.880,P1μg/m =0.001;t2.5μg/ml=11.963,P2.5μg/ml=0.000;t5μg/ml=4.482,P5μg/ml=0.008)；Con A体外刺激72h后,GIT2-/-的CD3+和CD4+T细胞增殖显著低于GIT2+/+的CD3‘和CD4+T细胞(t=3.838,P=0.012；t=6.215,P=0.001)。这些结果表明GIT2缺失抑制了CD3+和CD4+T细胞对Con A的反应性。为了进一步了解GIT2通过抑制T细胞功能,对Con A致肝损伤保护作用的分子机制,我们利用TCR经典信号通路的活化剂CD3抗体和CD28抗体,以及其非经典通路的活化剂PMA/Ionomycin,体外刺激CD3+和CD4+T细胞。结果发现CD3抗体加CD28抗体刺激后,GIT2-/-的CD3+和CD4+T细胞的活化和增殖均显著低于GIT2+/+的CD3+和CD4+T细胞,而GIT2-/-的CD3+和CD4+T细胞对PMA/Ionomycin刺激反应正常。该结果表明GIT2缺失致T细胞TCR信号通路障碍,进而导致T细胞的活化、增殖以及炎性细胞因子的产生能力降低,从而保护Con A介导的肝损伤。四、GIT2缺失对其他肝损伤的作用基于肝损伤的致病因素复杂多样性,我们采用CCl4、D-GalN/LPS以及30%肝部分切除模型初步探讨了GIT2在化学性肝损伤、内毒素急性肝损伤和手术切除肝脏损伤中的作用。小鼠存活率、血清转氨酶及病理学检测发现,CCl4和D-GalN/LPS模型中,GIT2-/-小鼠存活率降低,血清ALT、AST升高水平显著增加(t=4.125,P=0.015；t=5.149,P=0.007),CCl4模型该指标无差异,肝脏病理损伤程度加重。30%肝部分切除手术后,GIT2-/-小鼠血清ALT、AST升高水平略有降低,肝脏病理损伤无明显差异,但Ki-67免疫组化检测发现,GIT2缺失增加了肝部分切除诱导的小鼠肝细胞增殖,在切除后48h和72h时尤为明显。这些结果提示GIT2在不同致伤因素所致肝损伤中发挥不同作用,可能与不同因素的致损机制差异有关。综合上述研究结果,得出结论如下：1.GIT2可能参与肝脏的代谢解毒、糖原合成、蛋白质合成、能量供应、抗氧化功能、离子代谢功能以及免疫功能的调节。2.GIT2在肝病患者和Con A诱导免疫性肝损伤肝脏组织中表达增加。GIT2缺失对Con A诱导的免疫性肝损伤具有保护作用。3.GIT2缺失对Con A诱导免疫性肝损伤的保护作用,可能是通过阻滞Con A诱导的免疫细胞向肝脏组织浸润,促进具有免疫抑制功能的细胞浸润,并下调促炎细胞因子的产生,上调IL-10等抑炎细胞因子的表达,从而发挥对Con A诱导的免疫性肝损伤的保护作用；分子机制可能是GIT2缺失致T细胞TCR信号通路受阻,进而导致T细胞的活化、增殖以及炎性细胞因子的产生能力降低。4.GIT2缺失在不同因素致肝损伤中发挥不同作用,可能与不同因素的致损机制差异有关。