趋化因子系统指的是一些小分子炎症因子及其受体,他们参与调节感染、炎症以及组织修复相关的免疫反应,并且可以在胚胎形成阶段调控多种细胞的迁移。目前已经发现50多种趋化因子和19种趋化因子受体。本实验为了研究趋化因子类病毒受体,我们选择了严重急性呼吸道综合征病毒(SARS Coronavius, SARS-CoV) N蛋白和猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV )GP5蛋白作为研究对象,分别构建了人CXCL16和猪CXCR4真核表达载体,转染293FT细胞,通过体内外结合实验和激光共聚焦检测,探讨了SARS-CoVN与CXCL16是否可相互结合。构建了真核表达载体pcDNA3.1-CXCL12和pcDNA3.1-CXCR4,已证明重组的CXCL12具有趋化作用,重组的CXCR4的初步证明不能与GP5相结合。1.CXCL16与SARS-CoV N蛋白在细胞内外相互作用的研究为了研究宿主细胞内SARS-CoVN蛋白的相互作用蛋白,探索功能联系。构建真核表达载体pEGFP-N1/SARS-COVN、pdsRed2-N1/CXCL16并用磷酸钙法共转染293FT细胞,构建和纯化了带HIS标签的SARS-COVN-GFP融合蛋白并用于体外结合实验。激光共聚焦检测显示SARS-CoVN与CXCL16在293FT细胞的胞浆共定位,提示其相互作用可能是直接结合。荧光显微镜观察到纯化的SARS-COVN-GFP融合蛋白在细胞外可与表达在的细胞膜重组CXCL16结合上,说明二者能相互结合。2.猪趋化因子受体CXCR4真核表达以及与PRRSV的GP5蛋白相互作用的初步研究为了研究猪CXCR4的生物学功能,采用RT-PCR的方法从猪脾脏组织中扩增猪CXCL12基因的cDNA ,构建真核表达载体pcDNA3.1-CXCR4,再转染至HEK293FT细胞后,24h后经间接免疫荧光(IFA)检测CXCR4的表达,同时采用RT-PCR的方法从PRRSV中扩增GP5基因的cDNA并构建PRRSV的GP5蛋白的真核表达载体pEGFP-N1/GP5,转染293FT后收集纯化带GFP标记的GP5蛋白,观测其于转染pcDNA3.1-CXCR4是否相互作用。结果显示,双酶切鉴定和核酸序列分析证实pcDNA3.1- CXCR4真核表达质粒构建成功,转染HEK 293FT细胞后,IFA能够检测到CXCR4蛋白的表达。但GP5蛋白未能与转染pcDNA3.1-CXCR4的293FT细胞结合,初步说明二者不能相互作用。3.猪趋化因子CXCL12的克隆与真核表达为了研究猪CXCL12的生物学功能,采用RT-PCR的方法从猪脾脏组织中扩增猪CXCL12基因的cDNA ,构建真核表达载体pcDNA3.1-CXCL12,再转染至HEK293FT细胞后,24h后经间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(western blot)检测CXCL12的表达,用镍柱纯化表达的6×HIS-CXCL12融合蛋白并用体外趋化小室实验检测纯化的CXCL12蛋白对外猪周血单个核细胞,大鼠和小鼠的脾脏单个核细胞以及人淋巴细胞H9细胞系趋化能力。结果显示,双酶切鉴定和核酸序列分析证实pcDNA3.1-CXCL12真核表达质粒构建成功,转染HEK 293FT细胞后,IFA能够检测到CXCL12蛋白的表达,western blot显示表达的融合蛋白分子量约为17KD,纯化的6×HIS- CXCL12融合蛋白对猪外周血单个核细胞具有趋化能力,但不能趋化其他的细胞。