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目的分别构建T-bet和Ag85B真核表达质粒,将T-bet质粒作为基因佐剂与Ag85B质粒分子配伍构建新型DNA疫苗,并通过体内外实验观察其免疫调控作用,为结核等Thl失衡性疾病的防治提供新的理论与实验依据。方法1.根据GenBank报道的目的基因(Ag85B和T-bet基因)全长序列和pcDNA3.1(-)、pET-28a(+)质粒酶切位点的特点,用DNAClub和Premier Primer5软件设计特异性引物。PCR扩增出Ag85B和T-bet基因,分别利用限制性内切酶BamU Ⅰ、HindⅢ和Xho Ⅰ、 EcoR Ⅰ对相应PCR产物和空质粒pcDNA3.1(-)同时进行双酶切,纯化酶切产物,利用连接酶连接,经菌液PCR、酶切及测序鉴定重组质粒pcDNA3.1(-)-Ag85B和pcDNA3.1(-)-T-bet。2.将上述成功获得的重组质粒pcDNA3.1(-)-Ag85B经双酶切后,将酶切获得的Ag85B基因亚克隆至原核表达质粒pET-28a(+),回收目的基因与载体片段后酶连,转化DH5a筛选重组质粒,酶切鉴定原核表达质粒pET-28a(+)-Ag85B。3.将上述重组成功的质粒pET-28a(+)-Ag85B转化至大肠杆菌BL21(DE3),用诱导剂IPTG诱导表达重组蛋白rAg85B,经SDS-PAGE分析rAg85B表达情况并通过His柱亲和层析进行纯化,利用His单抗进行Westernblot鉴定。4.采用脂质体法转染重组质粒至RAW264.7细胞,于37℃,5%CO2温箱中培养24-48h后,Westernblot法检测质粒蛋白表达情况。5.3次肌肉注射免疫BALB/c小鼠,末次免疫2周后,ELISA法检测血清中抗Ag85B抗体滴度。同时将小鼠脾脏淋巴细胞于Ag85B刺激下培养,ELISA法检测培养液中细胞因子(IFN-γ/IL-2/IL-4/IL-10)分泌情况。结果1.利用特异性引物,以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA和健康小鼠脾脏淋巴细胞总RNA为模板扩增出目的基因片段,经DNA凝胶电泳鉴定DNA条带分别出现在1091bp和1608bp左右。2.真核表达重组质粒pcDNA3.1(-)-Ag85B、pcDNA3.1(-)-T-bet和原核表达质粒pET-28a(+)-Ag85B经菌液PCR、双酶切鉴定及测序验证后证实构建成功。3.转化了pET-28a(+)-Ag85B重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG诱导下表达重组蛋白rAg85B,经SDS-PAGE证实表达的rAg85B与预测的分子量大小相符,经亲和层析后获得纯化重组蛋白rAg85B。4.将不同浓度的真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ag85B、pcDNA3.1(-)-T-bet转染至RAW264.7细胞,经Western blotting证实FLAG-Ag85B和FLAG-T-bet蛋白均在转染细胞中表达,在一定范围内与重组质粒剂量成正相关。5.ELISA法检测免疫小鼠血清中抗Ag85B抗体变化情况,发现Vector组与T-bet组抗体滴度差异无统计学意义,而相比于Ag85B免疫组,Ag85B/T-bet组IgG2a滴度显著增高,IgGl滴度显著降低。6.ELISA法检测培养液中特异性Thl类(IFN-y/IL-2)和Th2类细胞因子(IL-4/IL-10)分泌情况,发现T-bet组与Ag85B/T-bet组各细胞因子含量无显著性差异。但Ag85B/T-bet组Thl类细胞因子(IFN-γ/IL-2)水平显著高于Ag85B组,而Th2类细胞因子(IL-4/IL-10)水平却显著降低。结论本实验初步阐明T-bet基因佐剂增强Ag85B特异性免疫应答作用,其抗体反应以IgG2a为主要的抗体亚类,刺激产生细胞因子以Thl型为主,诱导显著的Thl优势免疫应答。这为进一步研究其抗结核效应奠定了基础,同时为深入理解免疫增强型佐剂的意义及应用前景提供了理论基础及新思路。