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前言 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是引起人类呼吸道感染的常见病原体。支原体肺炎常于秋冬季发病，病人中儿童和青年人居多。本病约占细菌性肺炎的1／3以上，或占各种原因引起的肺炎的10％，近年来Mp感染有增加的趋势。支原体肺炎临床表现常呈非特异性，症状轻重不一，其病理形态可呈多种类型，与其他细菌或病毒感染引起的肺炎很难区分。此外，支原体与人体某些组织存在部分共同抗原，感染后可产生相应的自身抗体，形成免疫复合物，导致多系统的免疫损害，可继发全身多脏器损害及肺外并发症，如心血管症状、神经症状和皮疹出现，有时甚至危及生命。目前，支原体肺炎诊断的手段虽然很多，但尚无一种特异性和敏感性均较高的方法。本文应用培养-增强套式PCR法检测肺炎患儿的Mp感染，结合支原体分离培养和双份血清微量板凝集试验，探讨检测Mp感染的理想方法。 实验方法 1．标本来源 67例肺炎患儿均为2001年3～5月在中国医科大学附属一院、二院儿科病房住院的患儿。男，39例，女，28例，年龄3个月～14岁。 2．肺炎支原体的培养 支原体的培养基 支原体基础培养基，另加20％小牛血清20ml，50％葡萄糖0.4ml，青霉素0.5ml(20万U／ml)，0.4％酚红0.5ml，2.5％醋酸铊0.5ml，调节PH至8.0，用于Mp实验室菌株及临床标本的培养。 肺炎支原体的培养将灭菌棉签取样的咽拭子标本接种于2d支原体培养基中，按常规方法进行培养。24h后取出0．4 Inl用于套式nR，剩余的标本继续培养。二－ZW后，每天观察结果。若培养基变黄并透明澄清，可转种固体培养基，并做血吸附试验，鉴定是否为 MP感染；如标本培养 21d后，连续盲传 2次，同样时间培养仍无颜色改变的为阴性。 3．标本DNA的提取 肺炎支原体标准诛（MP FH）及临床标本 DNA的提取参照文献［‘1。操作过程为：取培养物 0．4 Inl在 4t10000 pm离心 10ndn，弃上清，沉淀用 100gi裂解液悬起（裂解液的成分为：500mMKCLJ0mM TiS－HCI，PH 8．3 NP40 0．45％，Proteinase k 10m牙Inl）将其置于 50t水浴箱中孵育 Zh，再在 95℃加热15ndn以使裂解液中的蛋白酶K灭活，该溶液即为DNA提取物。 4．套式PCR扩增 依据文献报道的Mp DNA基因序列合成两对扩增引物，第二对引物为 P；－15’－GCC ACC CTC GGG GGCAGT CAG—3’和 P；－6 5’一 ATC GCA nG CCG TCC TGC GTGG一3’扩增 P；基因的一个 272碱基对片段。在第二步 PCR过程中，采用引物 Pl－2 5’－CTG AAC GGG GGC GGG GTG AAGG－3’和 P；一3 5’一CAG hG GGA ’m’n CCC GCG GAGG—3’扩增一个 133 碱基对片段，引物由北京赛百胜生物有限公司合成提供。第二次扩增时被检测标本DNA模板量为10 gi，取扩增物2 gi进行第2次扩增。PCR反应的成分为：4 gi脱氧核耷酸三磷酸混合液，5叫PCR缓冲液（1X4… MgCI。、p5InM／L）和二…的 Taq多聚酶门 …入ZPmol引物，最后补充双蒸去离子水至 50 gi总容量，液面加人50gi石蜡油以防PCR循环过程中产物蒸发，每次实验均设阴性、阳性和空白对照，两次反应条件一致，均为95℃预变性5」n后，再行30个循环，每个循环为95℃15s，65℃二dn，72℃1．sndn，后延伸阶段为 72℃10ndn。取第 2次扩增产物 10 gi在二％ ·2·琼脂糖凝胶（含 0．5 pgllnl澳化乙锭）上电泳，紫外投射仪上观察记录结果，与阳性对照有相同条带的判为阳性。 5．血清学检测 采用微量板凝集试验，材料购自日本富士REBIO公司。实验方法及结果判定参照说明书进行，实验同时设定对照。若单份血清抗体滴度）卜80或第二份血清与第一份血清相比抗体滴度升高4倍或以上者判为阳性。 6．统计学方法 所有数据均经X’检验。 实验结果 1．培养－增强套式PCR法（nPCR）和培养法检测MP的比较 培养法检出阳性4例，检出率为6．0％，而培养一增强套式PCR法检出阳性 17例，检出率为 25．4％，二者之间有显著性差异（X‘＝＝二二．52 P＜0．＊二）。 2．培养－增强套式PCR法和微量板凝集试验检测Mp的比较nPCR肺炎支原体感染的检出率为25．4％厂 X双份血清检出率为20．9％O ＊2种检测方法的检出率无显著性差异。（X‘＝0．39 P＞0．05）。单份血清检出率为 9．0％（6／67），nPCR法对肺炎支原体的检出率明显高于单份血清微量板凝集试验的检出率＊’＝6．35 P＜0．of人以双份血清抗体滴度呈 4倍增长为诊断Mp感染的黄金标准，则 nPCR法灵敏度为 85．7％，特异度为＊．6％。 3．培养－增强套式PCR产物特异性 采用引物根据文献设计合成，特异性较高。本实验设阳性和阴性对照，阳性标本均出现预计的扩增条带，而阴性标本均末出现扩增条带。 4．培养－增强套式PCR产物敏感性 把MP FH标准株接种于液体培养基中，在37℃温箱中培养IW，依据文献提取＊＊A，分别取0．6Inl刀．4ml刀．ZInl和0．lrnl的培养液，当只?