甲醇营养型毕赤酵母（Methylotrophic Pichia pastoris）是近年来广泛应用的一种外源蛋白表达系统。利用重组毕赤酵母实现各类外源蛋白产品的高效生产,除了选育或构建优良菌种外,发酵过程控制与优化技术也是提高外源蛋白发酵生产性能的一种有效手段。在毕赤酵母表达外源蛋白过程中,甲醇浓度、溶解氧浓度（Dissolved oxygen concentration,DO）、细胞浓度或生长速度等关键状态变量是影响毕赤酵母表达外源蛋白的最主要因素之一。但是,启动外源蛋白表达通常在毕赤酵母达到极高密度条件下进行,这时,甲醇浓度、DO和细胞浓度（生长）三者之间相互影响相互耦联,同时将上述状态变量控制在最优水平存在困难,外源蛋白表达水平也很难得到提升。针对上述问题,本论文以甲醇利用快型（Mut⁺）/甲醇利用慢型（Mut^S）毕赤酵母表达几种典型外源蛋白的诱导过程为研究对象,系统性地研究探讨了不同甲醇流加/供氧/细胞生长条件下的毕赤酵母碳代谢以及能量代谢变化特征和模式,并据此提出和建立了适用于不同Mut⁺/Mut^S型菌株、具有一定普适效果的甲醇诱导关键过程控制技术,提高了外源蛋白的产量或活性。论文的主要研究内容和结论总结概括如下:（1）利用Mut⁺/Mut^S型毕赤酵母生产外源蛋白的诱导过程在极高细胞密度(¹00g-DCW·L^-1)下进行。通常通空气供氧条件下,毕赤酵母细胞的高耗氧特性导致甲醇浓度和DO相互影响和耦联,无法同时得到控制。可行的控制策略只有两个:即在策略A:“低甲醇浓度-高DO”(甲醇浓度0-1 g·L^-1/DO¹0%)和策略B:“高甲醇浓度-低DO”(甲醇浓度5-10 g·L^-1/DO⁰%)进行诱导。研究探索了Mut⁺/Mut^S型毕赤酵母在上述两种诱导环境下生产外源蛋白过程中的发酵性能。结果表明,Mut⁺型毕赤酵母生产人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子突变体融合蛋白（HSA-GCSF^m）时,次优诱导控制策略（sub-optimal induction strategy）是策略A:即“低甲醇浓度-高DO”。此时,HSA-GCSF^m浓度达到了0.59 g·L^-1的最高水平,是使用策略B下的6.56倍。相反,Mut^S型毕赤酵母生产猪?干扰素（pIFN-?）时的次优诱导控制策略是策略B:即“高甲醇浓度-低DO”。此时,pIFN-?浓度达到了1.86 g·L^-1的最高水平,是使用策略A下的2.35倍。此外,将上述“次优诱导控制策略”应用于其它Mut⁺/Mut^S型毕赤酵母生产几种不同外源蛋白的过程中,验证了其通用能力。（2）利用转录组学/代谢分析方法对上述“次优诱导控制策略”强化Mut⁺/Mut^S型毕赤酵母生产外源蛋白的机理进行了探究。结果表明“低甲醇浓度-高DO”诱导环境强化Mut⁺型毕赤酵母表达HSA-GCSF^m的原因在于:甲醇/山梨醇代谢途径中差异表达基因上调及碳源（甲醇/山梨醇）利用速度/DO同时控制在其适宜水平,这有效地抑制了有毒代谢产物的胞内积累、碳代谢得以高效运行。与此同时,氨基酸合成途径差异表达基因上调及泛素-蛋白酶体合成途径中差异表达基因下调进一步提高HSA-GCSF^m的合成效率。另一方面,“高甲醇浓度-低DO”诱导环境强化Mut^S型毕赤酵母生产pIFN-?的原因在于:甲醇代谢、过氧化物酶体合成途径中差异表达基因上调及甲醇利用速度维持在较高水平,确保了甲醇诱导强度并有效抑制中间代谢产物的胞内积累,核糖体蛋白合成途径差异表达基因上调可进一步提高了pIFN-?的翻译效率。（3）研究了上述Mut⁺/Mut^S型毕赤酵母生产外源蛋白诱导阶段内甲醇利用的动力学特征。结果发现:Mut⁺型毕赤酵母生产HSA-GCSF^m过程中,在不同甲醇浓度下毕赤酵母利用甲醇速度基本维持在恒定水平;与之相反,Mut^S型毕赤酵母生产pIFN-?过程中,Mut^S型毕赤酵母利用甲醇速度依赖于甲醇浓度,并随甲醇浓度的下降而逐渐降低。这可从表观上进一步解释了Mut⁺/Mut^S型毕赤酵母利用各自的“次优诱导控制策略”促进外源蛋白表达的代谢机理。最后根据上述结果,提出了Mut⁺/Mut^S型毕赤酵母表达外源蛋白过程中的甲醇利用速度动力学模型。（4）Mut^S型毕赤酵母高密度发酵生产外源蛋白过程中的次优诱导控制策略是“高甲醇浓度-低DO”环境。然而,当毕赤酵母细胞长期处于高甲醇、DO受限的诱导环境时,甲醇代谢的第一个反应-甲醇氧化反应成了律速步骤,进入到胞内的甲醇得不到有效利用、导致胞内甲醇积累,外源蛋白无法长期持续表达。本文提出了一种甲醇周期诱导控制策略,即周期性地将诱导环境从“高甲醇浓度-低DO”（T₁=7 h）切换至“低甲醇浓度-高DO”（T₂=4 h）,维持5-6周期。采用该甲醇周期诱导控制策略,可以在维持甲醇诱导强度的同时,有效地利用胞内积累的甲醇,将胞内甲醇浓度控制在低水平,细胞代谢活性和外源蛋白合成速度均得到了显著增强。将该策略用于pIFN-?和人源溶菌酶（hLYZ）的表达生产,与“高甲醇浓度-低DO”诱导控制策略相比,蛋白浓度和活性大幅提升,pIFN-?和hLYZ蛋白浓度和活性分别达到2.01 g·L^-1、3.90×10⁷ IU?mL^-1和1.47g·L^-1、2.15×10⁵ IU·mL^-1的最高水平,相应目标蛋白的活性分别提升了86%和69%。（5）在低细胞浓度(?50 g-DCW·L^-1)下启动甲醇诱导,可在一定程度上缓解DO难以控制的问题,有利于目标外源蛋白的表达。但是,其机制机理尚鲜有报道。本文将该诱导控制策略用于Mut^S型毕赤酵母表达生产甜味蛋白（monellin）过程。碳代谢和能量代谢分析结果表明,使用该诱导控制策略甲醇流向外源蛋白合成前体途径中的比例达到了65.2%的最高水平,且甲醇走向蛋白前体合成途径与能量代谢途径中的比例匹配、能量利用效率最大。同时,外源蛋白合成速度与细胞生长速度完全耦联且具有最大的耦联系数,细胞比生长速度也处于较高水平。30℃诱导条件下的最终甜味蛋白浓度达到了2.62-2.71 g·L^-1的最高水平,比高细胞浓度(?100 g-DCW·L^-1)下启动甲醇诱导进行发酵条件下提高了150%-390%。此外,在利用Mut⁺/Mut^S型毕赤酵母生产其它不同外源蛋白的过程中,也使用该诱导控制策略进行外源蛋白表达,产量/活性均有提高,碳代谢和能量模式与前述的结果基本吻合。