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目的:慢性髓细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）细胞内的致癌蛋白BCR-ABL具有组成型激活的酪氨酸激酶活性,可以激活下游一系列信号通路,促进癌细胞的生存与发展。针对BCR-ABL激酶活性的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）的应用在临床上取得了良好的治疗效果,但部分病人出现了耐药现象,且不能将被认为是白血病致病根源的白血病干细胞（Leukemia stem cells,LSCs）清除,因此亟需寻求新的治疗靶点。有研究发现在LSCs中多种组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）表达失调,HDAC抑制剂展现出良好的抗肿瘤活性,但是泛HDAC抑制剂的副作用多,靶向某一特定的HDAC能够克服这一缺点。HDAC6是一种Hsp90α去乙酰化酶,研究发现其在CML病人的干、祖细胞中异常高表达。Hsp90α是一种伴侣蛋白,它可以稳定BCR-ABL构象,防止蛋白降解。HDAC6的活性缺失会导致Hsp90α高乙酰化,失去其伴侣活性,从而导致客户蛋白BCR-ABL降解,因此,本研究拟使用HDAC6特异性抑制剂ACY-1215靶向HDAC6,探究其对CML细胞的作用及其机制。方法:1.第一步是搜寻GEO数据库,分析CML病人骨髓细胞中HDAC6的表达情况,然后收集临床样本,分离骨髓细胞后通过RTq PCR检测HDAC6 m RNA表达水平,通过western blot和RT-q PCR检测多种白血病细胞株中HDAC6的蛋白及基因表达。第二步用HDAC6特异性抑制剂ACY-1215处理后,采用CCK-8检测CML细胞活性,克隆形成实验检测CML细胞增殖能力,western blot和FCM检测CML细胞凋亡以及细胞周期变化。2.采用Co-IP检测ACY-1215处理CML细胞前后Hsp90α的乙酰化情况及其与BCR-ABL的结合情况,并采用western blot检测BCRABL下游信号分子Stat5和Crkl的变化。FCM检测ROS的变化情况,并使用NAC抑制ROS后FCM检测细胞凋亡及细胞周期,western blot检测PTEN/Akt轴的变化情况。3.采用FCM检测ACY-1215联合IM处理CML细胞后的凋亡情况,使用Compusyn软件计算两药的联合指数。构建TKI耐药CML小鼠异种移植瘤模型,使用ACY-1215、IM单独或联合治疗,通过HE和免疫荧光观察白血病细胞浸润以及对生存时间进行分析。结果:1.GEO数据库结果分析表明,CML患者骨髓干、祖细胞中HDAC6表达显著高于正常人。本实验显示在部分CML病人中HDAC6m RNA也呈高表达,且在多种白血病细胞株中HDAC6转录水平和蛋白水平都显著高表达。ACY-1215以剂量依赖性显著抑制CML细胞活性和CML细胞增殖,使细胞周期阻滞于G1/S期,并诱导CML细胞凋亡。2.ACY-1215诱导Hsp90α的乙酰化,从而减弱BCR-ABL与Hsp90α的结合,导致BCR-ABL降解,并抑制Stat5和Crkl信号通路。还发现ACY-1215可以显著诱导CML细胞ROS的产生,并且抑制ROS可以部分回复ACY-1215诱导的细胞凋亡以及周期阻滞。实验结果显示ROS可以从转录水平以及翻译水平调节PTEN表达,而western blot结果表明ACY-1215可以诱导PTEN表达增加以及抑制下游p-Akt活性,而Akt激动剂可以部分回复细胞活性。这些结果显示ACY-1215可以通过ROS/PTEN/Akt通路抑制CML细胞活性。3.FCM结果显示,ACY-1215和IM联合处理CML细胞可以诱导更高的细胞凋亡率,并且使用compusyn软件计算联合指数,结果显示ACY-1215与IM具有协同效应。体内实验结果表明,尽管单药对IM耐药的CML小鼠没有明显的抗肿瘤效应,但是ACY-1215联合IM可以显著减轻IM耐药的CML小鼠的白血病细胞浸润,延长小鼠生存期。结论:HDAC6在CML病人中显著高表达,HDAC6特异性抑制剂ACY-1215可以抑制CML细胞活性,促进细胞凋亡。其机制是通过影响Hsp90α的伴侣活性,抑制BCR-ABL与Hsp90α结合,从而抑制BCRABL信号通路。还通过提高ROS的产生,诱导PTEN表达,抑制Akt活性,达到杀伤CML细胞的目的。并且ACY-1215可以协同IM杀伤CML细胞,体内研究结果显示ACY-1215单药并未展现出良好的抗肿瘤效应,但是联合IM可以显著减轻耐药CML小鼠的白血病负担,延长小鼠生存期。本研究的结果表明HDAC6可能是克服TKI耐药的一个理想靶点,HDAC6抑制剂联合TKI的使用或许能够对TKI耐药病人展现良好的抗肿瘤活性。