研究背景：气道上皮细胞凋亡是COPD发病的重要机制之一,而内质网应激(ERS)介导的细胞凋亡亦越来越被重视。在烟草等有害物质刺激下,细胞通过启动未折叠蛋白反应(UPR)减少蛋白合成、增加未折叠蛋白的降解以减轻细胞对应激环境负担。在内质网应激状态下,PERK通路首先激活并具有极其重要的作用。PERK通过寡聚化和自身磷酸化活化,导致其下游因子真核翻译起始因子2α亚单位(eIF2α)磷酸化,磷酸化的eIF2a可直接抑制蛋白合成,致使新生的多肽流出内质网以减轻其负担,维持细胞内环境平衡。而当刺激持续,内质网应激将诱导caspase家族、CHOP等的表达诱导细胞凋亡。体外研究发现在PERK/eIF2a这条通路被敲除后,细胞对内质网应激所致凋亡敏感性增加,而增强PERK/eIF2a通路,细胞凋亡减少,证明上调PERK通路在ERS中具有对抗细胞凋亡的作用。基于目前在COPD发病中,PERK/eIF2a通路在内质网应激诱导的细胞凋亡中如何作用,其与CHOP、caspase关系尚不明确,拟以COPD大鼠及香烟烟雾提取物(CSE)干预人支气管上皮细胞(HBE)为主要模型,探讨PERK通路相关信号分子、凋亡信号指标及之间关系,研究PERK通路的活化剂salubrinal在其中的作用,旨在证实PERK通路在COPD内质网应激诱导的细胞凋亡中具有重要作用,为临床治疗COPD提供新的理论基础和治疗靶点。第一章PERK/eIF2a通路在COPD大鼠支气管肺组织中凋亡中的作用目的：观察PERK通路在COPD大鼠内质网应激所致支气管肺组织是否活化及salubrinal对香烟烟雾所致气道上皮细胞凋亡的影响。方法：36只Wistar大鼠随机均分为3组：正常对照组、COPD模型组、COPD模型加药物组(简称干预组)。采用被动吸烟加气管内滴注脂多糖(LPS)法建立大鼠COPD模型,药物组在滴注脂多糖的同时气管内滴注salubrinal(1mg/kg)。造模完成后,测定各组大鼠的肺功能；观察肺组织病理学变化；免疫组化检测p-PERK、 p-eIF2a、caspase-12在支气管肺组织中的表达和分布；western blot检测p-PERK、p-eIF2α、active caspase-12和active caspase-3蛋白水平；TUNEL法检测支气管肺组织上皮细胞凋亡。结果：模型组的各项肺功能指标较正常组均明显降低,但以salubrinal干预后大鼠各项肺功能指标较于模型组有明显升高。在模型组中内质网应激PERK通路的指标p-PERK、p-eIF2a较正常组相比增高,而干预组的p-eIF2a的表达水平最高；模型组的凋亡指标active caspase-12和active caspase-3表达较正常组明显升高,干预组凋亡较模型组减少。结论：(1)采用气管内滴注脂多糖加烟熏的方法成功地构建了COPD大鼠模型；(2) COPD大鼠支气管肺组织发生了内质网应激,启动了PERK介导的UPR信号通路；(3) salubrinal可保护COPD模型大鼠支气管肺泡上皮细胞免于凋亡,可能通过调节PERK/eIF2a通路活性来实现其保护作用。第二章PERK/eIF2a通路在CSE诱导人支气管上皮细胞凋亡的作用目的：观察CSE对HBE细胞PERK通路相关蛋白表达的影响,并探讨PERK通路在内质网应激诱导的细胞凋亡中的作用机制。方法：第一部分,体外培养HBE细胞,给予5%CSE对其进行不同时间(0h-24h)的干预后,以western blot、免疫荧光等分别检测p-PERK, p-eIF2a蛋白表达；第二部分,以不同浓度的salubrinal(0-100uM)干预CSE所刺激的HBE细胞,得出其对细胞具有保护作用,且保护作用随浓度增加而增加；再将HBE细胞分为六个处理组：对照组,5%CSE组,salubrinal组,salubrinal (1μM)+5%CSE组,salubrinal (10μM)+5%CSE组,salubrinal (100μM)+5%CSE组,以Western blot分别检测p-PERK、p-eIF2a和caspase4蛋白的表达水平,AnnexinV-PI双标流式法测细胞凋亡。第三部分,小干扰PERK后,再以5%CSE及salubrinal干预HBE细胞,以RT-PCR检测PERK mRNA水平,Western blot检测p-PERK、p-eIF2α、active caspase-3、4蛋白表达水平,AnnexinV-PI双标流式法测细胞凋亡。结果：随着CSE浓度的增加或干预时间的延长,HBE细胞p-PERK及p-eIF2a蛋白表达量逐渐增加,以5%CSE、干预6h组增加最明显,但继续增加CSE浓度或延长干预时间,p-PERK及p-eIF2a表达并不增加,反而下降；salubrinal (0-100uM)干预CSE所处理的HBE细胞,得出对细胞具有保护作用,且其作用随浓度增加而增加,其最大保护浓度为100uM,以salubrinal干预后的细胞组其p-eIF2a蛋白表达量较其他组明显升高；小干扰PERK后,RT-PCR、 western blot检测小干扰组PERK表达显著下降,PERK siRNA成功下调了PERK基因表达；PERK水平下调后,HBE细胞active caspase-3、caspase-4的蛋白表达水平和细胞凋亡与单纯的CSE刺激组比较显著升高,但以salubrinal干预后的凋亡水平较CSE干预组低,且p-eIF2α蛋白含量增加,但p-PERK表达无统计学差异。结论：(1)PERK/eIF2a通路负调控内质网应激抵抗CSE诱导的HBE细胞凋亡,其完整性是HBE细胞存活的关键通路；(2) Salubrinal可以保护CSE所诱导的HBE细胞免于凋亡；(3) Salubrinal可能通过增强PERK通路活性来保护HBE细胞免于内质网应激所致凋亡。