肿瘤的抗体导向酶—前药疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy, ADEPT)是将单抗与酶制成偶联物,注射到含有对应抗原的肿瘤患者体内,利用单抗将酶导入并驻留于肿瘤部位,经过一段时间,待血液和其它组织中抗体-酶偶联物廓清之后,给予无毒性的前药,肿瘤部位的酶将前药转变为活性药物,杀死肿瘤细胞。ADEPT结合了单抗的靶向性和酶的高效性,同时能提供旁观者效应杀死单抗-酶偶联物结合细胞周围的肿瘤细胞。ADEPT系统的设计包括抗体优化,使其保留靶向性降低免疫原性；酶的选择；偶联物的构建；前药的设计,合成,优化等方面。为了实现靶向性治疗,单抗-酶偶联物在生理条件下应有活性,低免疫原性,最好不要选用人体内源性的酶以避免前药在正常组织被激活。单抗-酶偶联物设计的重要前提是要保证抗体对抗原的结合能力和酶的催化活性。其偶联的化学键应稳定,因为给予偶联物和前药之间有一定的时间间隔,需要等正常组织和血液中的偶联物廓清,在这段时间内抗体-酶偶联物之间不能断裂。以保证其停留在肿瘤部位。ADEPT应用的前药为酶的底物与细胞毒性药物的偶联物,前药本身无毒性或毒性很小,只有被酶激活,才会释放原药产生细胞毒性。由于肿瘤部位易渗漏,因此应选择半衰期短的原药；烷化剂和核酸嵌合剂由于其与靶分子的结合多是不可逆的,半衰期短,且其代谢物无毒性较为适合做ADEPT系统的原药。RGD4C (ACDCRGDCFCG),是含有两个二硫键的环形RGD多肽,对肿瘤新生血管内皮细胞的结合能力很强。在重组蛋白的研究中,有很多研究小组将RGD4C与肿瘤坏死因子、白细胞介素等大分子重组后得到新的靶向蛋白,具有很好的靶向性且不影响所连蛋白生物活性。RGD4C具有分子量小,特异性高的特点,比较适合作为ADEPT系统中的抗体部分。p-内酰胺酶是一个单链蛋白,分子量相对较小,性质稳定且易于纯化；其与单抗组成的融合蛋白,在血浆中的清除速度快,应用于ADEPT时不需要使用清除抗体,可在注射融合蛋白一定时间待其与肿瘤细胞结合后直接给予前药进行治疗,治疗方案简单；β-内酰胺酶与底物亲和力高,作用时不需要辅酶；作为一种可溶性蛋白,β-内酰胺酶可以在大肠杆菌中量产,便于产业化；因此非常适合作为ADEPT系统中的酶。我们选择RGD4C和β-内酰胺酶(βL)重组构建RGD4C-β-内酰胺酶融合蛋白(RGD4C β L)作为ADEPT系统的单抗-酶偶联物,并考察了该融合蛋白的活性,血浆稳定性,免疫原性,靶向性；并合成了对应的前药头孢-美法仑,检测了RGD4CβL对前药的催化活性,考察了该系统对人乳腺癌细胞MCF-7的杀伤作用。本实验采用头孢硝噻吩作为底物,考察RGD4C β L的活性；并以人血浆孵育的方法考察了RGD4Cβ L的稳定性。实验结果表明RGD4C β L保留了β-内酰胺酶的催化活性,其在人血浆中37℃孵育14天仍保留了较好的活性。本实验采用人外周血单核细胞增殖试验和小鼠脾细胞增殖试验考察RGD4C βL的免疫原性,实验结果表明RGD4C βL对人外周血单核细胞和小鼠脾细胞的刺激作用均在可接受范围,具有较小的免疫原性。本实验采用流式细胞术考察了RGD4C βL对MCF-7细胞的结合能力；并用放射性标记,利用小动物活体成像和组织分布实验考察了RGD4C β L在荷瘤裸鼠体内的分布特性。实验结果表明RGD4C βL对MCF-7细胞有较好的结合能力,且该能力与RGD4C相当；活体成像和组织分布实验表明,RGD4Cβ L在肿瘤组织的分布高于正常组织,且主要通过泌尿系统代谢。两个实验证明RGD4CβL具有-定的肿瘤靶向性。本实验合成了RGD4C βL的对应底物,头孢-美法仑前药；并用细胞增殖试验考察了RGD4C βL-头孢美法仑系统对MCF-7细胞的作用。实验结果表明RGD4C β L和头孢美法仑前药对细胞无毒性；只有在两者联合应用时才能释放原药美法仑产生细胞毒作用。通过以上实验可以得知,RGD4C βL融合蛋白保留了RGD4C的靶向性和β-内酰胺酶的催化活性,且具有较好血浆稳定性,较低的免疫原性,有希望应用于ADEPT系统。