论文部分内容阅读
植物螯合肽是广泛存在于生物体内的重金属结合多肽,其合成途径中的关键酶为植物螯合肽合成酶(phytochelatin synthase,PCS)。它可催化底物谷胱甘肽(GSH)合成植物螯合肽,从而有效解除重金属对生物体的毒性。紫球藻作为水体中的生产者,其光合作用受重金属胁迫而显著下降。为了探讨重金属离子对紫球藻光合作用的影响途径,以及紫球藻PCS(PpPCS)基因在抵抗重金属胁迫中的作用,本实验进行如下研究: 1、采用Multi color PAMWin测定不同浓度Cd2+分别胁迫处理紫球藻24h、48h、72h、96h和120h各实验组叶绿素荧光参数,结果表明:荧光参数Fv/Fm、Yield、ETR和qP随Cd2+浓度增加均明显降低,NPQ总体呈现先上升后下降的趋势,细胞密度、藻胆蛋白含量以及ATP含量也明显降低,光合特性受到显著影响。 2、以NCBI和紫球藻基因组数据库为基础,利用反转录PCR技术,成功克隆得到紫球藻植物螯合肽合成酶基因(PpPCS)的ORF序列,序列长度为1476 bp,共编码491个氨基酸。 3、利用在线软件对PpPCS基因进行生物信息学分析,可知,该基因属于植物螯合肽合成酶(PCS)家族,其编码蛋白质的分子量约为53.99KDa,为偏酸性、不稳定、弱亲水性蛋白。该蛋白不具有信号肽序列,合成后在细胞内发挥作用。磷酸化位点分析显示,该蛋白丝氨酸磷酸化位点较多,但不具有酪氨酸磷酸化位点。二级结构预测表明,该蛋白具有16处α螺旋,8处β折叠,中间通过转角结构相互连接。 4、以100μmol/L的Cd2+分别胁迫处理紫球藻0h、1h、2h、4h和8h,采用qPCR技术检测PpPCS基因在转录水平上的相对表达量变化,结果显示,相对表达量先上升后缓慢下降,表明PpPCS基因可通过调节表达量参与紫球藻抵抗重金属胁迫的过程。 5、将PpPCS基因与pET-28a原核表达载体连接,并转入BL21原核表达菌株中进行原核表达,SDS-PAGE电泳结果显示,已成功从重组表达菌株中诱导产生目的蛋白,但目的蛋白不可溶,在细胞中以包涵体的形式存在。 6、将PpPCS基因与pYES2真核表达载体连接,并转入INVSc1酵母表达菌株中进行真核表达,数据分析表明,与对照组相比,转化pYES2-PpPCS酵母菌株具有很强的Cd2+耐受性,进一步证实PpPCS基因具有使生物体抵御重金属胁迫的功能。 本文对紫球藻PpPCS基因进行克隆、生物信息学分析和表达研究,为进一步研究该基因的功能及抗胁迫机制奠定了重要的基础。