急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征是引起重症患者急性呼吸衰竭的最主要的原因,死亡率高达40%。临床前研究发现,骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)移植可以减轻多种实验性肺损伤,包括LPS、博莱霉素、机械通气和缺血再灌注诱导的肺损伤。早期的研究发现,BMSCs可以通过分化为肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞或内皮细胞来促进肺损伤修复。近年来,一些实验研究发现BMSCs可以通过一些旁分泌的因子调节炎症反应来修复肺损伤。小鼠脓毒症模型中,BMSCs通过释放前列腺素E2促进巨噬细胞抗炎因子IL-10的产生,从而降低死亡率和减轻肺损伤。BMSCs通过旁分泌IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist, IL-1ra)抑制巨噬细胞介导的炎症反应,从而保护博莱霉素诱导的小鼠肺部炎症性损伤。一些实验性肺损伤中,肾上腺素能受体激动剂特别是β肾上腺素能受体激动剂,可以通过促进肺水吸收和抑制炎症反应来促进肺损伤修复。肾上腺素能受体激动剂还可以促进胚胎干细胞和BMSCs的DNA合成,保护间充质干细胞的氧化应激损伤。本研究首先评估BMSCs移植对大鼠盐酸吸入性肺损伤的作用及其机制；研究不同的肾上腺素能受体激动剂和拮抗剂对BMSCs生物学行为的影响;在体外模型中研究肾上腺素对BMSCs迁移的影响,并且在体外和体内实验中评估肾上腺素是否可以帮助BMSCs调节炎症反应和修复实验性肺损伤,同时初步探讨其机制。第一部分骨髓间充质干细胞移植减轻大鼠盐酸吸入性肺损伤的作用及其机制目的：研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠盐酸吸入性肺损伤的作用并探讨机制。方法：本实验于复旦大学附属中山医院实验研究中心进行。改良贴壁法分离培养Sprague-Dawley (SD)大鼠BMSCs,进行形态学、表面标记物和诱导分化鉴定。24只SD大鼠随机分为3组：对照组,损伤组和移植组。损伤组和移植组气道内滴注盐酸(1.2 ml/kg, pH=1.5),对照组则滴入等量磷酸缓冲盐溶液(PBS),用动脉血气、肺组织湿干比和病理改变评价模型是否成功建立。移植组于颈外静脉注射5×106个BMSCs,其它2组注入0.5 ml的PBS。移植6h后行动脉血气分析,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)的肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)浓度,观察肺组织病理改变和测定肺组织湿干比。体外实验中,BMSCs与损伤肺细胞或正常肺细胞于Transwell体系共培养36 h,观察损伤肺影响BMSCs迁移情况；另取BMSCs与损伤肺细胞混合培养或于Transwell中培养,正常肺细胞或损伤肺细胞单独培养作对照,6h后检测上清TNF-α、IL-6和IL-10浓度。用方差分析比较多组间的差异,独立样本t检验比较两组的差别。结果：分离培养的BMSCs具有间充质干细胞的特征。BMSCs移植改善了肺损伤大鼠的低氧血症(P<0.01)和肺组织损伤,降低了肺组织湿干比(P<0.01),降低了血清和BALF的TNF-a水平(P<0.05；P<0.01),升高了血清和BALF的IL-10浓度(P<0.01),对IL-6水平无明显影响(P>0.05)。体外实验中,BMSCs向损伤肺迁移明显多于向正常肺迁移(P<0.01),BMSCs与肺细胞接触或不接触的共培养均降低了上清液TNF-a浓度(P<0.01),升高了IL-10浓度(P<0.01),对IL-6浓度无影响(P>0.05)。结论：BMSCs移植可以减轻大鼠盐酸吸入性肺损伤,可能的机制为干细胞通过旁分泌途径下调炎症反应。第二部分肾上腺素能受体参与骨髓间充质干细胞增殖的研究目的：研究不同的肾上腺素能受体激动剂和拮抗剂对BMSCs生物学行为的影响。方法：用不同浓度的肾上腺素(0-100 gM),α受体激动剂去甲肾上腺素,β受体激动剂异丙肾上腺素,或联用肾上腺素和受体拮抗剂作用于BMSCs,在Cell-IQ实时细胞监测平台观察细胞增殖、死亡和运动。每5 min拍摄一次,连续观察72 h后计算细胞总数增加百分比、分裂细胞数、死亡细胞数和细胞移动距离。结果：10μM浓度的肾上腺素同对照相比,可以显著加速细胞增殖,这个作用6h时开始出现,18-24 h时达到高峰；而促进细胞分裂的作用逐渐出现,36h时到达高峰。1μM浓度的肾上腺素对细胞增殖无显著影响,而100 u M的肾上腺素可以抑制增殖。各浓度的肾上腺素对死亡细胞数和细胞运动距离无影响。因此后续实验选择10u M浓度进行研究。10μ M浓度的去甲肾上腺素和异丙肾上腺素促进细胞增殖的作用类似,而均弱于同样浓度的肾上腺素。去甲肾上腺素和异丙肾上腺素对细胞死亡和细胞运动均无明显影响。10μM浓度的酚妥拉明和普萘洛尔和肾上腺素分别联用时,对细胞增殖有类似的抑制作用。酚妥拉明和普萘洛尔和肾上腺素分别联用时,对细胞死亡和运动无显著影响。结论：10μM浓度的肾上腺素具有促进BMSCs增殖的作用,并且是肾上腺素能受体相关的,α或β受体激动后均有促增殖效应。第三部分肾上腺素刺激的骨髓间充质干细胞促进LPS诱导急性肺损伤修复的作用及机制探讨目的：评估肾上腺素刺激的BMSCs是否可以减轻体内和体外模型中的LPS肺损伤并探讨其机制。方法：将正常大鼠的肺细胞或LPS损伤大鼠的肺细胞与BMSCs(有或无肾上腺素刺激)共培养于Transwell中(膜孔径8 um),36h后计数迁移的BMSCs数量。另将正常大鼠或LPS损伤大鼠的肺组织块与BMSCs(有或无肾上腺素刺激)共培养于6孔板中,24h后观察并计数向肺组织迁移和粘附的BMSCs数量。LPS刺激的巨噬细胞和BMSCs共培养于Transwell中(膜孔径0.4 um),6h后取上清液ELISA检测NF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-13,血管生成素-1,KGF和IL-1ra浓度。同时取BMSCs用实时定量PCR测血管生成素-1, KGF, IL-1ra, IL-10和IL-13基因表达。Western blot测BMSCs的IL-10, IL-13, KGF和IL-1ra蛋白表达。初步的动物实验用于验证体外实验的发现,大鼠静脉注射BMSCs,肾上腺素刺激的BMSCs, BMSCs(有或无肾上腺素刺激)的条件培养液,肾上腺素或PBS进行预处理,24 h后气管内注射LPS造模。造模后24h观察肺组织病理改变。结果：10μ M浓度的肾上腺素促进了BMSCs向损伤肺细胞的迁移,还促进了向损伤肺组织的迁移和粘附。体外肺损伤模型中,肾上腺素刺激的BMSCs降低了TNF-a和IL-1 β浓度,升高了IL-10浓度,促进了炎症反应的下调,而这个作用可能与肾上腺素促进一些旁分泌因子包括血管生成素-1,KGF, IL-1ra, IL-10和IL-13的表达和分泌有关。动物实验中,肾上腺素刺激的BMSCs促进了肺损伤的修复。结论：肾上腺素通过肾上腺素能受体激活BMSCs,促进BMSCs增殖和向损伤肺的迁移,与损伤肺相互作用,调节炎症反应,从而促进了肺损伤的修复。结论1. BMSCs移植可以减轻大鼠盐酸吸入性肺损伤,可能的机制为干细胞通过旁分泌途径下调炎症反应。2.10μ M浓度的肾上腺素具有促进BMSCs增殖的作用,并且是肾上腺素能受体相关的,α或β受体激动后均有促增殖效应。3.肾上腺素激活BMSCs,促进BMSCs增殖和向损伤肺的迁移,与损伤肺相互作用,调节炎症反应,从而促进了肺损伤的修复。创新点1.我们的研究首次发现,在体外共培养模型中,损伤肺组织可以促进BMSCs的迁移和粘附,而这个作用可能与损伤肺分泌的细胞因子有关。2.我们首次发现肾上腺素可以促进BMSCs的增殖和迁移,帮助调节炎症反应,从而促进实验性肺损伤的修复。潜在应用价值肾上腺素能受体激动剂可以用于体外刺激和活化BMSCs或其它类型的MSCs,再进行移植,以提高存活分化率和改善肺损伤修复。