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摘要：目的：肝癌是全球癌症第三号杀手,术后复发转移率很高,这成为肝癌临床治疗的难题。干细胞治疗是目前正在探索的肿瘤新型生物治疗方法之一。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)由于能够向肿瘤迁移、免疫原性低等特性有望成为抗肿瘤因子靶向治疗的理想载体；凋亡素具有对正常细胞无毒性的广谱抗肿瘤特性；腺病毒载体具有毒性低、转基因持续表达等优点。但目前将MSCs、腺病毒及凋亡素联合应用于肝癌抑制作用的研究尚未见报道。本论文构建表达凋亡素的腺病毒并感染人骨髓MSCs,通过一系列实验,探索MSCs向肝癌细胞的迁移及其腺病毒载体介导的凋亡素修饰的MSCs对肝癌细胞的体外抑制作用。本研究的开展探讨了癌症的干细胞疗法,为癌症的临床治疗提供新的途径与实验依据。同时为干细胞为载体的新型体内给药系统的研究奠定基础,有望解决腺病毒载体直接递送药物引起的免疫排斥问题。方法：首先,利用transwell进行MSCs与HepG2共培养,检测MSCs向肝癌细胞HepG2的迁移能力。其次,根据GeneBank上登录的凋亡素Apoptin(vp3)基因序列,全基因合成vp3,经过修饰后获得凋亡素的编码基因为466bp；将vp3基因插入穿梭载体pAd-Track-CMV(含有GFP基因),获得穿梭质粒pAdTrack-CMV-vp3;利用Pme Ⅰ线性化上述鉴定成功的质粒,并转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的RecA+Ecoli BJ5183感受态细胞,构建pAd-vp3重组质粒,并通过限制性内切酶方法鉴定分析；Pac Ⅰ消化pAd-vp3去除抗性基因及原核复制元件,获得重组腺病毒Ad-vp3；随后转染293细胞并扩增,获得高滴度的病毒颗粒。利用此高滴度的病毒颗粒感染MSCs,收集病毒颗粒感染后的MSCs培养上清,利用Western Blot检测凋亡素的表达,从而获得表达凋亡素蛋白的MSCs；收集稳定表达凋亡素的MSCs的条件培养基作用于HepG2,同时将稳定表达凋亡素的MSCs和HepG2共培养,检测对HepG2的抑制作用。结果：通过迁移实验证明,MSCs具有明显向肝癌细胞HepG2迁移的能力(P<0.01)；成功构建了可表达凋亡素Apoptin的重组腺病毒Ad-vp3,感染293细胞,获得了高滴度(1.0×1012pfu/mL)的病毒颗粒,提取病毒基因组,检测到凋亡素基因的存在,证明符合构建目的；高滴度的病毒颗粒感染MSCs后,利用Western Blot检测发现感染后的MSCs培养上清中有凋亡素的表达,从而获得表达凋亡素蛋白的MSCs;体外抑制实验表明,稳定表达凋亡素的MSCs和HepG2共培养后,表达凋亡素的MSCs可以显著抑制HepG2的增殖(P<0.01)。同时,稳定表达凋亡素的MSCs的条件培养基也可以明显抑制HepG2的增殖(P<0.05),但对正常细胞没有抑制作用。结论：本实验成功地利用腺病毒系统构建了重组腺病毒Ad-vp3,感染MSCs获得了表达凋亡素的MSCs,并证明经凋亡素修饰的MSCs及其条件培养基均可以明显抑制HepG2的增殖,为探讨癌症的干细胞疗法提供新的途径与实验依据。