病毒感染可以激活宿主的免疫系统,包括天然免疫防御系统和获得性免疫应答防御系统。天然免疫反应主要发生在病毒感染的早期且与抗病毒感染紧密相关。干扰素作为重要的抗病毒因子,可清除病毒。细胞受到病毒刺激后,经过一系列信号级联反应,导致干扰素产生,进一步激活下游JAK-STAT信号途径,诱导下游大量抗病毒基因的转录,最终起到抗病毒作用。泛素化作为一个重要的翻译后修饰途径,在调控病毒诱导的干扰素信号通路中起着至关重要的作用。蛋白泛素化调节是一个可逆过程,细胞中还存在一些去泛素化蛋白酶(deubiquitination enzymes, DUBs)进行逆向调节。去泛素化由DUBs介导,同样在天然免疫反应中起着重要的作用,近几年更是人们研究的热点。而泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases, USPs)作为DUBs中成员最多且结构最具多样性的一类半胱氨酸酶,以其结构和功能的多样性和复杂性受到了科研界的广泛关注。近些年关于USPs的报道也层出不穷,揭示了其广泛的生物学活性。为了更加全面的了解这一家族的结构和功能特征,本研究围绕USP25的结构和功能以及其在调控干扰素信号通路中的作用进行了深入的研究,具体研究内容如下：1.USP25负调节仙台病毒(SEV)诱导的干扰素刺激应答元件(ISRE)的激活以及干扰素刺激基因(ISGs)的表达干扰素刺激应答元件(IFN-stimulated response element, ISRE)作为干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)启动子调控区的应答元件,可以启动ISGs的转录,并在抗病毒中扮演着重要角色。本研究利用双荧光素酶的方法对54个USPs干扰之后进行筛选,发现USP25显著增强仙台病毒(Sendai virus, SEV)诱导的ISRE启动子活性。进一步超表达USP25显示其显著抑制SEV诱导的ISRE启动子活性,且呈剂量依赖性。Real-Time RT-PCR结果表明USP25显著抑制多种ISGs的转录。表明USP25参与抗病毒天然免疫反应。2.USP25负调控Ⅰ型干扰素信号通路的分子机制双荧光素酶以及Real-Time RT-PCR结果显示USP25显著下调SEV诱导的p干扰素(interferon-β, IFN-β)转录。进一步干扰USP25之后发现USP25表达下调显著激活SEV诱导的IFN-β转录,表明USP25负调控SEV诱导的干扰素表达。干扰素表达需要干扰素调节因子3(interferon regulatory factor3, IRF3)与核因子κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)的活化以及共同作用。双荧光素酶检测结果显示USP25显著抑制SEV诱导的IRF-3以及NF-κB的激活。Western blot结果发现USP25同时抑制IRF-3以及p65的磷酸化。提示USP25通过抑制SEV诱导的IRF-3以及NF-κB的激活抑制IFN-β产生。3.USP25去泛素化活性检测及其去泛素化活性位点的鉴定USP25虽然属于DUBs中的成员,但并不是所有的DUBs都具有去泛素化活性。经纯化或者体内表达的USP25均能将K48或K63连接形式的泛素从泛素化蛋白上移除,表明USP25存在去泛素化活性。USPs含有保守的半胱氨酸盒(Cys-box)和组氨酸盒(His-box),与天冬氨酸/天冬酰胺(Asp/Asn)一起构成起催化作用的三联残基。通过氨基酸序列比对推测USP25的第178位C(半胱氨酸)以及第607位H(组氨酸)为其去泛素化活性位点。为了验证这一推测,进一步构建了USP25突变体(C178A、H607A)的真核表达质粒,Western blot检测结果证实第178位C(半胱氨酸)以及第607位H(组氨酸)确实为USP25的去泛素化活性位点。4.USP25的去泛素化活性参与其抑制Ⅰ型干扰素信号通路双荧光素酶研究发现USP25丧失DUB活性后,其抑制IFN-P活性显著丧失,表明USP25的DUB活性参与其抑制SEV诱导的IFN-p转录。USP25显著抑制甲酸诱导基因I(retinoic acid-induced gene-I, RIG-I)、β-干扰素启动子刺激物1(interferon-β promoter stimulator1, IPS-1)、TNF受体相关因子2(TNF receptor-assciated factor, TRAF2)以及TNF受体相关因子6(TNF receptor-assciated factor, TRAF6)等干扰素调节蛋白激活的干扰素表达。免疫共沉淀实验发现USP25可以显著去除RIG-I、TRAF2以及TRAF6的泛素化,而失去去泛素化活性的USP25突变体(C178A、H607A)则不能去除RIG-I、TRAF2以及TRAF6的泛素化,结果证实USP25的去泛素化活性对抑制病毒诱导的干扰素表达起着重要的作用。