背景：肿瘤治疗方法主要包括手术切除、放疗、化疗、介入治疗、高强度聚焦超声治疗、射频消融、激光治疗等。化疗为传统治疗的重要手段之一,具有以下独特优势：①作用于分裂期细胞,包括肿瘤干细胞,治疗肿瘤原发病灶及远处转移灶；②降低机体免疫抑制。然而,化疗疗效受到某些因素的限制：①抗肿瘤药物在肿瘤组织内难以达到有效浓度；②静脉给药所致的全身不良反应限制了给药的剂量；③抗肿瘤药物的半衰期一般较短,肿瘤组织内难以稳定地维持有效药物浓度。因此,提高肿瘤局部药物浓度是化疗的关健。大量的实验研究表明,超声激励微泡“空化效应”能够提高肿瘤细胞内药物浓度,抑制瘤体生长。超声波辐照微泡,微泡发生振荡、收缩、膨胀等一系列动力学过程,即“空化效应”；由此产生的微束流或冲击波能使微泡周围的细胞膜形成孔隙,即“声孔效应”,膜外的分子进入细胞内。“声孔效应”又分为“可逆声孔效应”和“不可逆声孔效应”。治疗超声激励微泡增强肿瘤化疗已有大量的文献报道,很多学者探讨了治疗超声声强度、脉冲方式、占空比、频率、辐照时间等参数优化问题：评估微米级微泡、液—气相变微泡、载药微泡以及同时具备诊断和治疗功能的微泡等对疗效的影响；观察不同肿瘤细胞和移植瘤模型的疗效。二维诊断超声激励微泡也有文献报道,适宜的机械指数(MI)、辐照时间,二维诊断超声激励微泡能够在细胞膜上形成孔隙；增强微血管的通透性,红细胞外溢,骨髓—间充质干细胞也可以透过微血管壁至心梗部位诱导微血管新生。而实时三维超声激励微泡的实验研究鲜有报道。离体细胞实验,造影剂微泡直接混于肿瘤细胞悬液中,贴近细胞。在体实验,造影剂微泡采用经静脉注射途径给予,微泡在微血管内流动,且受肺循环的影响。已有文献证实,采用瘤内注射途径给予微泡联合治疗超声辐照能够增加肿瘤细胞内镧颗粒数目；但透射电镜图显示细胞内镧颗粒只有2个。临床诊断超声设备,超声场的强度用机械指数(MI)表示,机械指数取决于峰值负压的最大值(Pr)和声场的中心频率(f)。MI<0.3,认为声场强度是低的；0.3<MI<0.7,超声波对新生的肺组织和肠管可能存在轻微的损伤；MI>0.7,无论液体中是已否存在微气泡,都有可能发生“空化效应”,且这一可能性随着MI值的增大而增大；临床诊断超声设备MI设置的上限为1.9。造影剂微泡——声振方式制备的全氟丙烷人血白蛋白微球注射剂(“全氟显”),人血白蛋白包裹核心气体全氟丙烷制成平均直径为2.5～4.0μm的微球混悬液。核心气体全氟丙烷的血中溶解度非常低,因此气体难于从微球中扩散至血液,全氟丙烷气体可稳定的存在于微球中随血流流经全身；当采用经兔耳缘静脉注射的途径给予“全氟显”时,微球流经肺循环,因全氟丙烷核心气体的气血分配系数非常大,按照亨利定律,一部分核心气体全氟丙烷将会迅速从肺毛细血管进入到大气中,剩余一定比例的“全氟显”跨肺进入左心,随血流流经各脏器微循环实现该部位的超声显影。“全氟显”在微血管内循环时,由于其粒径多在微米级,不能透过微血管壁进入组织间隙,超声和微泡的相互作用主要发生在血管腔,以直接损伤血管内皮为主。兔VX2肿瘤是由Shope病毒在兔皮肤上诱发产生的恶性乳头状瘤,经72次传代培养后正式建立命名为VX2,是一种可移植的廇株,无排斥反应,可接种在兔的任何内脏、骨骼及软组织内稳定地生长。兔VX2肌肉肿瘤模型与接种于肝、肾、骨骼、肺等部位的肿瘤模型相比具有其独特的优势：①肿瘤位置表浅,可通过经皮肤表面扪及的方式早期发现成瘤,可用于早期肿瘤治疗的研究及疗效评价；而其他部位接种的肿瘤位置较深,其观察常需要借助影像学手段,也易受时间和空间的制约,致使发现成瘤的时间相对延后。②发生转移的时间较晚、部位较单一,接种25天后才发现肺部有小的转移灶,至自然死亡时仅发现肺转移；其他部位接种的肿瘤均较早发生肺、肝、纵膈淋巴结和大网膜等部位的转移。因此,该模型是一种较为理想的用于肿瘤局部治疗疗效评价及局部治疗对肺转移影响的动物模型。肿瘤体积>2mmm3或肿瘤细胞个数>107个时,肿瘤继续增殖所需的充足氧气和营养物质就需要由生成新生血管来提供。肿瘤体积增长超过1-2mmm3,若无新生血管伸入,肿瘤组织将会持续休眠或者发生退化。一旦新生血管伸入肿瘤内,供给充足的血液,肿瘤组织将快速生长并且难以制止。多柔比星(Dox)为蒽环类抗肿瘤药物,抗瘤谱广,广泛应用于实体瘤和血液恶性肿瘤的治疗,对乏氧细胞有效；临床上一般使用其盐酸盐,为橘红色结晶,易溶于水；Dox口服吸收不良,临床上一般静脉注射给药或者动脉给药；药物通过主动转运进入细胞；阻止DNA的复制,也影响PNA的转录。研究显示Dox在整个细胞周期均有活性作用,包括细胞间期。Dox独具荧光特性,易于检测其在细胞内的药物浓度。本项实验研究在于观察实时三维超声激励微泡能否增强移植瘤化疗,造影剂微泡采用瘤内注射途径给予。实时三维超声,一方面可以显示较深部位肿瘤,另一方面可以对肿瘤进行辐照。本实验中建立的VX2移植瘤模型,发生转移的时间较晚、部位单一,接种25天后才发现肺部有较小的转移灶,至自然死亡时仅仅发现肺转移。对肌层内的肿瘤进行实时三维超声辐照联合瘤内注射微泡,以期为深部位肿瘤行实时三维超声激励瘤内注射微泡增强化疗的实验研究提供基础。目的探讨实时三维超声辐照瘤内注射造影剂微泡增强VX2移植瘤化疗效果的可行性。材料和方法1.主要实验材料实验仪器与试剂：①超声辐照仪采用具有诊断作用的ViVi E9(GE公司制造)3V-D探头,频率1.5～4.0MHz。超声诊断仪采用Philips iU22彩色多普勒超声仪,L9-3高频线阵探头,频率4.0～9.0MHz,配有超声造影模式。②造影剂微泡采用“全氟显”(南方医科大学南方医院自制),其成膜材料为人血白蛋白,核心气体为全氟丙烷。实验时以3ml生理盐水溶解并缓慢摇匀,制成混悬液用做瘤体显影及瘤内注射,所产生微泡粒径范围2.5～4.0μm,浓度0.8～2.2×109个/m1；瘤内注射微泡体积=1/2×瘤体体积。③注射用盐酸多柔比星(Dox,深圳万乐药业有限公司)10mg/瓶,每瓶5ml生理盐水稀释,每只兔1.2ml/kg经兔耳缘静脉注射。其他试剂：速眠新Ⅱ注射液,阿托品,3%戊巴比妥钠,肝素。实验动物：29只健康新西兰大白兔,雌雄不限,体质量2～2.5kg。另取2只健康新西兰大白兔,供廇株传代用。所用实验动物均由南方医科大学实验动物中心提供。2支冻存的VX2廇株由中山大学实验动物中心提供。2.VX2移植瘤模型2支冻存的VX2廇株常规复苏,分别制备成2.0ml组织悬液,分别取1ml接种至传代兔右后肢外侧肌层内各1处。第14天,运用0.35ml/kg速眠新Ⅱ注射液和0.25ml/kg阿托品注射液将传代兔进行肌肉注射麻醉,并建立耳缘静脉通道以注射适量3%戊巴比妥钠,侧卧位固定于实验台上,荷瘤部位及其周围1.5cm处脱毛,充分暴露,碘伏及酒精先后分别消毒两次,无菌条件下取出瘤体,并迅速剔除周边结缔组织及中央坏死区,将剩余的新鲜鱼肉样组织置于无菌生理盐水中,眼科剪将其剪成1mm3的瘤粒,接种至29只健康新西兰大白兔右后肢外侧肌层内,均1处。3.实验方法超声诊断仪监测肿瘤生长情况：第11天,24只新西兰大白兔存活,且瘤体造影剂微泡充盈,大小0.2～0.9cm3,全部用于实验。具体步骤如下：①随机分为4组。A组：空白对照(Control),不给予任何治疗；B组：单纯静脉注射注射多柔比星(Dox):C组：实时三维超声辐照瘤内注射造影剂微泡(3-D+Bubble)；D组：实时三维超声辐照瘤内注射造影剂微泡及静脉注射多柔比星(3-D+Bubble+Dox).②超声诊断仪定位肿瘤。③超声辐照仪输出强度的机械指数(MI)1.3,频率1.5～4.0MHz,辐照时间为20min；超声诊断仪引导下瘤内注射微泡；经兔耳缘静脉缓慢注射多柔比星；3V-D探头立即辐照瘤兔；第1、3、5、8天对肿瘤进行治疗。④第10天取材,HE染色观察肿瘤病理组织学；每次治疗前及第10天取材前测量瘤体大小：超声诊断仪探测肿瘤最大纵切面,测量肿瘤最大上下径(a)、前后径(b),在与最大纵切面垂直的切面上测量瘤体最大左右径(c),并计算肿瘤体积、瘤体相对生长率及总体生长率；4组分别依次进行。4.肿瘤体积、瘤体相对生长率及总体生长率肿瘤体积(V)=Π/6×a×b×c(cm3)瘤体相对生长率=(Vn-V1)/(Vn’-V1’)×100%,(Vn,V1)、(Vn’,V1’)分别是处理组和对照组第n天及第1天治疗前的体积瘤体总体生长率=(V10-V1)/(V10’-V1’)×100%5.统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件包对数据进行处理,肿瘤体积用x±s表示。单因素方差分析比较同一时间组间瘤体相对生长率及总体生长率。P<0.05为差异具有统计学意义。结果①HE病理组织学：D组以凝固性坏死为主,C组广泛的细胞固缩,B组坏死细胞分布于排列紊乱无极性的肿瘤细胞之中,A组浸润性生长的肿瘤细胞中见不同程度细胞坏死。②治疗期间B、D组都能抑制瘤体生长,但以D组抑制效应更明显,C组瘤体的生长受到了促进作用,A组瘤体持续生长。结论实时三维超声激励瘤内注射微泡联合静脉注射多柔比星对VX2移植瘤具有明显的抑制效应。