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实验一:不同激活剂对PRP形成凝胶及释放生物活性物质影响的实验研究目的:了解葡萄糖酸钙和凝血酶对富血小板血浆(PRP)激活后形成富血小板凝胶(PG)及释放生物活性物质的影响。方法:采集6名志愿者血小板制备PRP。应用2种常用激活剂——葡萄糖酸钙和凝血酶,观察PRP激活状态下富血小板凝胶(PG)形成时间及形成情况,HE染色及透射电镜观察下PG中纤维蛋白分布及血小板超微结构,ELISA法上清液中多种生长因子浓度,纳米颗粒跟踪分析仪检测血小板来源的不同直径微囊泡浓度,对数据进行t检验。结果:(1)凝血酶激活组PG形成时间(228±40)s明显短于葡萄糖酸钙激活组(690±71)s,(t=15.17,P<0.01)。(2)HE染色显示及透射电镜显示,激活1 h,凝血酶激活组PG中血小板均呈碎片状;葡萄糖酸钙激活组PG中可见正在裂解的血小板、α颗粒结构及未裂解的α颗粒、致密体结构。(3)凝血酶激活组释放的PDGF-BB浓度(7.4±0.8)ng/mL明显高于葡萄糖酸钙激活组[(4.9±0.5)ng/mL,t=5.41,P<0.01]。葡萄糖酸钙激活组释放的bFGF浓度为(960±151)pg/mL,明显高于凝血酶激活组[(384±56)pg/mL,t=8.75,P<0.01]。2组释放的其余生长因子浓度相近(t值分别为0.11～1.97,P值均大于0.05)。(4)葡萄糖酸钙激活组释放的总微囊泡浓度分别为(165.8±15.1)×108/mL明显高于凝血酶激活组[分别为(24.7±4.6)×108/mLt值为17.36,P值小于0.01]。结论:凝血酶和钙离子激活血小板凝胶形成时间、生长因子浓度及微囊泡浓度有显著性差异,两种激活剂适用于不同临床治疗的选择。实验二:ADM/PRP复合冻干敷料促进创伤愈合的研究目的:探索ADM/PRP复合冻干敷料制备,观察复合材料扫描电镜特性和生长因子含量,观察其对小鼠全层皮肤缺损愈合情况。方法:(1)选取成品ADM颗粒和添加有血小板冻干冻干保护液的PRP按照一定比例混合冻干,观察制成品材料扫描电镜下的结构,ELISA法测定复合材料PBS溶解后上清液 VEGF、bFGF、EGF、IGF-I、TGF-β1、PDGF-BB 浓度。(2)动物模型的建立:雄性C57鼠(20-22g)84只,8周龄。随机分为4组,前一天晚上小鼠禁食,次日上午进行3%水合氯醛麻醉,在小鼠背部脊柱正中靠后部位制作直径为0.8cm的圆形全层皮肤缺损创面。实验分为四组:Control组即空白对照组,此组使用生理盐水涂抹创面;PRP组即富血小板血浆对照组,皮肤缺损部位涂抹及注射PRP组;ADM组即脱细胞真皮基质颗粒组,创面覆盖脱细胞真皮基质颗粒。ADM/PRP组即实验组—富血小板血浆复合脱细胞真皮基质颗粒材料组,创面用富血小板血浆复合脱细胞真皮基质颗粒材料覆盖包扎。(3)创面形成后3d、5d、7d、10d、14d观察分析创面愈合情况,计算创面愈合率。分别在3d、5d、7d、10d、14d各组处死三只,并于创缘2mm取材固定,标本行HE、Masson染色分别观察再上皮化、肉芽组织形成炎症细胞浸润和胶原纤维情况。α-SMA免疫组化标记α平滑肌肌动蛋白,观察肌成纤维细胞分布;CD31免疫组化标记内皮细胞,观察各组组织中新生血管情况;CD68免疫组化标记单核-巨噬细胞及树突状细胞,观察炎症细胞浸润情况,统计学分析。结果:(1)SEM可见ADM/PRP复合冻干敷料形成网状空隙,胶原蛋白结构明显,可见未激活血小板附着在ADM上。ADM颗粒成块状聚集,未见明显空隙结构。生长因子检测结果示:ADM/PRP溶解液VEGF、bFGF、EGF、TGF-[31、PDGF-BB浓度明显低于PRP原液,有显著差异(p<0.05)。(2)ADM-PRP复合材料组10天组创面愈合率明显高于其他三组,有显著差异(p<0.05)组织愈合时间缩短。HE染色示:早期ADM/PRP复合冻干敷料上皮化化速度快、基底层较厚,愈合后上皮角化好,胶原厚,结构接近正常皮肤组织;Masson及α-sma染色示:ADM/PRP组较其他组肌成纤维细胞增殖明显,愈后胶原排列整齐;CD31示:ADM/PRP组5、7d血管化作用高于其他组;CD68染色:5d阳性细胞数ADM/PRP组、ADM组和PRP组明显高于对照组,有显著性差异(p<0.05)。结论:(1)ADM/PRP复合冻干后可形成多孔三维支架材料;血小板负载在ADM上可保持其一定的生物活性。(2)ADM/PRP复合冻干敷料在促进急性模型中,愈合速度和质量优于ADM颗粒和PRP单独使用,其机制可能涉及促进皮肤愈合上皮化、血管化、成纤维细胞增殖和胶原新生作用。