欧美杨108号转蜘蛛杀虫肽+Bt毒蛋白嵌合基因研究

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:luoweitao2007
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杨树是世界上中纬度地区广泛栽培的重要速生用材树种,但是杨树的虫害种类多,危害十分严重,尤其是大面积的杨树人工林。而杨树抗虫基因工程为解决这个难题提供了一条有效途径。欧美杨108号(Populus nigra×Populus deltoids“108”)是美洲黑杨(Populus nigra)与欧洲黑杨(Populus deltoids)的人工杂种无性系。本研究以欧美杨108号为外植体材料,利用农杆菌介导法成功地将抗虫基因(蜘蛛杀虫肽+Bt毒蛋白的嵌合基因)导入该受体中。通过试验得出以下结论: (1) 通过除菌抗生素的筛选试验,可以看出在7种抗生素中以注射用头孢唑啉钠抑菌效果最佳,因此,试验所选用的除菌抗生素为注射用头孢唑啉钠; (2) 根据叶片对头孢唑啉钠的敏感试验,最终确定除菌时,头孢唑啉钠的浓度为1000mg/L; (3) 叶片的敏感试验结果表明,在筛选转化体时,卡那霉素的临界浓度确定为30mg/L; (4) 通过生根敏感试验,最终确定选择生根培养基卡那霉素的临界浓度为20mg/L; (5) 成功建立欧美杨108号的遗传转化程序:菌株活化→叶片预培养2~3d→液体菌株OD600=0.05~0.1,侵染5~10min→37℃,共培养2~3d→头孢唑啉钠1000mg/L脱菌,卡那霉素30mg/L筛选→脱菌、筛选数次→获得卡那霉素抗性芽→一个月后,转入生根培养基中(头孢唑啉钠1000mg/L脱菌,卡那霉素20mg/L筛选)生根培养→获得卡那霉素抗性植株; (6) 试验侵染转化95个叶盘共1713个叶片,获得卡那霉素抗性芽8个,转化率为4.67‰; (7) 经PCR检测,凝胶电泳结果显示,8个卡那霉素抗性芽中,6个存在目的基因: (8) 在以上6个存在目的基因抗性芽分化的若干植株中,平均每个样抽取3株,取其叶片做GUS检测,结果显示,全部叶片均呈阳性,GUS阳性为100%: (9) 经PCR-Southern印迹杂交检测,结果进一步表明,目的基因(蜘蛛杀虫肽+Bt毒蛋白的嵌合基因)已成功整合到欧美杨108号基因组内。
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