甘草次酸是补益药甘草的主要药理活性成分,具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节剂、肾上腺皮质激素样作用等广泛的药理作用,但其不溶于水,生物利用度很低。脂质体是一种人工制备的携有双层包膜的磷脂质小囊,可作为各类治疗药剂的人工膜和赋形剂。它可使所包裹的药物具有靶向作用,准确地击中病变部位、组织和细胞,从而增强药物的疗效。同时脂质体还具有缓释作用,能延长药物的作用时间,降低药物的毒性,减少药物的副作用等。现代研究表明,脂质体具有明显的免疫增强作用。脂质体作为免疫增强剂也越来越受关注。若用脂质体对甘草次酸进行包封,不仅能够解决这些溶解性问题,还能发挥两者的优势。本研究采用薄膜分散法,制备出一种新型的免疫佐剂即甘草次酸脂质体(glycyrrhetinic acid liposome, GAL),并选用响应面法筛选最佳处方；通过体内和体外试验,研究了GAL对动物淋巴细胞增殖、抗体效价、细胞因子、树突状细胞功能、巨噬细胞吞噬功能等免疫方面的影响,旨在研制一种高效、低毒的免疫增强剂并初步阐明其免疫增强作用机理。试验分为以下七个部分：试验Ⅰ甘草次酸脂质体制备条件的优选采用薄膜分散法制备甘草次酸脂质体。为了优选GAL制备的最佳条件,以包封率和载药量为指标,分别考察了超声时间、脂药比、膜材比、水浴温度和水化介质5个单因素。在单因素试验的基础上,采用响应面法研究了脂药比、膜材比和水浴温度3个因素对脂质体包封率的影响。经过Design-Expert软件分析数据,得到脂质体的最佳制备条件：脂药比为9.0：1,膜材比为2.5：1,水浴温度为31℃。结果显示：按最优条件制备的脂质体包封率较高,可达83.46%±0.55%。试验Ⅱ甘草次酸脂质体体外对鸡淋巴细胞增殖和两种免疫球蛋白浓度的影响将GAL、GA和BL分别用无血清的RPMI1640培养液稀释成11个浓度,加入到长成单层的鸡胚成纤维细胞中,用MTT法判定各试验药物的安全浓度。将安全浓度以下5种浓度的GAL、GA和BL分别单独或协同PHA加入到鸡外周血淋巴细胞中,同样将GAL、GA和BL分别单独或协同LPS加入到脾淋巴细胞中,用MTT法分别测定T淋巴细胞增殖和B淋巴细胞的增殖情况。采用ELISA法测定B淋巴细胞分泌的IgG和IgM的浓度。结果表明,GAL的安全浓度高于GA；单独或协同PHA刺激,GAL在8.750-0.547 μg·mL-1时均能显著促进鸡外周血淋巴细胞的增殖,并且在4.375-0.547μg·mL-1时,效果优于GA和BL; GAL单独或协同LPS刺激,在8.750-0.547μg·mL-1范围内,均能显著促进脾淋巴细胞的增殖,且在8.750-1.094μg·mL-1时,效果都显著优于GA和BL。GAL在8.750μg·mL-1时可显著增加IgG的浓度,在8.750-4.375μg·mL-1时可显著增加Ig,M的浓度,且效果优于GA和BL试验Ⅲ 甘草次酸脂质体体外对三种鸡细胞因子mRNA转录的影响为了研究GAL增强免疫的作用和分子机理,用Primer Primier5.0软件自行设计引物白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ (IFN-γ)3对引物。培养鸡外周血淋巴细胞,分别加入3种浓度的GAL、GA和BL,另设LPS对照组,培养36h后收集细胞,提取总RNA,然后对其进行反转录。用荧光定量PCR方法测定GAL对鸡外周血淋巴细胞IL-2、IL-4和IFN-γ的mRNA转录的影响。结果显示,在8.750 μg·mL-1、2.188 μg·mL-1、0.547 μg·mL-1时,GAL促进外周血淋巴细胞3种细胞因子mRNA的转录能力显著强于GA和BL,且在8.750μg·mL-1时的作用最强。这可能是GAL增强机体免疫的分子机制之一试验Ⅳ甘草次酸脂质体对鸡新城疫疫苗免疫应答的影响为探索甘草次酸脂质体对鸡新城疫疫苗免疫应答的影响,将210只14日龄雏鸡随机均分为7组,用新城疫Ⅳ系苗以滴鼻、点眼的方式进行首次免疫,28日龄进行二免。在首免的同时,试验组分别肌肉注射高、中、低剂量的GAL, GA对照组注射GA溶液,BL对照组注射BL,疫苗组和空白对照组(注射等量生理盐水),空白对照隔离饲养。于首免后第7、14、21、28、35、42 d心脏和翼静脉采血,采用β-微量法测定血清抗体效价的动态变化；采用双抗体夹心法测定免疫球蛋白IgG、IgM的浓度变化；MTT法测定外周血T淋巴细胞增殖情况；采用双染色标记法对淋巴细胞进行标记,经流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+的含量变化。结果表明,GAL在合适的剂量和某些时间点能显著提高血清抗体效价,增加IgG、IgM的浓度,促进T淋巴细胞增殖以及提高T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+的含量,且免疫效果优于GA和BL。综上可知GA经脂质体包封后,二者可协同增强免疫,综合评价以GALH、GALM增强免疫的效果较好。试验V甘草次酸脂质体对OVA免疫小鼠免疫应答的影响将210只5周龄小鼠随机均分为7组,用以甘草次酸脂质体为佐剂的OVA进行皮下免疫,并与6、7周龄分别进行二免和三免。免疫时,试验组分别注射高、中、低剂量的GAL, GA对照组注射GA溶液,BL对照组注射BL,油佐剂组和空白对照组注射等量生理盐水。于首免后第7、14、21、28、35、42 d摘眼球采血后处死,无菌取脾脏,分别采用ELISA法测定IgG、IL-2和IFN-γ的浓度变化,采用MTT法测定脾T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖情况。结果表明,GAL在合适的剂量和某些时间点能显著增加IgG、IL-2和IFN-γ的浓度,促进T、B淋巴细胞增殖。综上可知,GA经脂质体包封后,二者可协同增强免疫,综合评价GALH、GALM的免疫效果较好。试验Ⅵ 甘草次酸脂质体对小鼠树突状细胞功能的影响 为了研究甘草次酸脂质体的免疫增强作用机理,本试验从小鼠骨髓中分离树突状前体细胞,将安全浓度以下7种浓度的GAL、GA和BL分别加入树突状前体细胞,用MTT法检测药物对树突状前体细胞增殖的影响。用重组因子rmG-CSF和诱导rmIL-4培养树突状细胞。收集培养至第8天的未成熟DCs经药物刺激后,与小鼠脾淋巴细胞和OVA混合培养,用MTT法检测药物DCs抗原递呈能力的影响；与经油佐剂包裹OVA免疫过的小鼠脾淋巴细胞混合培养,用MTT法检测药物对DCs激活并刺激T淋巴细胞增殖能力的影响。结果显示,在和0.875 μg·mL-1浓度范围内,GAL能显著促进树突状前体细胞的增殖；在2.188-0.547 μg·mL-1范围内,GAL不仅能显著增强DCs抗原提呈能力,而且能8.750-0.547 μg·mL-1有效激活并刺激T淋巴细胞的增殖。试验Ⅶ 甘草次酸脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 为了探究甘草次酸脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能的影响,将6%的淀粉肉汤注入小鼠腹腔,3 d后处死小鼠,收集腹腔液体,分离培养巨噬细胞。贴壁后,向细胞中分别加入5种浓度的和BL,培养48 h后,加入中性红,继续GAL、GA培养4 h,测定巨噬细胞吞噬中性红的情况。结果显示,在范8.750-0.547 μg·mL-1围内,GAL组的OD490值与BC组差异不显著。可见GAL增强巨噬细胞吞噬功能的作用不明显。